小鼠肝脏中细胞类型特异性基因表达谱分析

通过TRAP-seq技术，我们可以分离特定细胞类型中的RNA，例如在受损肝脏中重新填充的肝细胞，以分析这些细胞中发生的基因表达变化。该方法无需从组织中去除不需要的细胞。细胞类型特异性的RNA是通过亲和纯化从整个器官裂解液中分离得到的。

该技术有助于我们确定特定细胞对损伤的反应方式，从而可能帮助识别出治疗肝病的新策略或药物。该方法可用于研究肝细胞对不同类型的肝损伤的反应。目前，针对严重的急性肝损伤治疗选择有限，而该方法将有助于揭示新的治疗方法。

该方法最初起源于脑部研究。在肝脏中，我们设想它可用于检测多种细胞类型的动态变化，例如肝细胞、胆管细胞、库普弗细胞和内皮细胞等。演示该实验操作的是我的研究生兼指导学生 Amber Wang。

首先，通过轻柔吹打重悬磁珠。将磁珠置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液。随后，将微量离心管从磁力架上取下，加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），再通过上下吹打洗涤磁珠。

将离心管重新放回磁力架上静置超过一分钟，以收集磁珠并吸除PBS。为制备蛋白L包被的磁珠，向重悬并洗涤后的磁珠中加入16微升生物素标记的蛋白L，并加入1× PBS，若使用1.5毫升微量离心管，则调整终体积至1毫升，若使用2毫升微量离心管，则调整至1.5毫升。将磁珠与生物素标记的蛋白L在室温下于旋转仪上孵育35分钟。

然后，将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液以收集蛋白L包被的磁珠。从磁力架上取下微量离心管，加入1毫升含3% BSA的PBS缓冲液，轻轻吹打至少五次以洗涤蛋白L包被的磁珠。再次将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，吸除上清液以收集包被的磁珠。

将BSA洗涤步骤再重复四次。接着，将50微克的GFP抗体19C8和50微克的GFP抗体19F7分别加入蛋白L包被的磁珠中，在4°C条件下于旋转仪上孵育一小时。为收集亲和基质，将离心管置于磁力架上静置超过一分钟，然后移除上清液。

将离心管从磁力架上取下，加入1毫升低盐缓冲液。轻轻吹打混匀以洗涤亲和介质，并重复低盐缓冲液洗涤步骤两次。用200微升低盐缓冲液重悬珠子，制成200微升亲和介质悬液。

首先，设置组织研磨器，使聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管在匀浆过程中可置于冰上。向聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管中加入 4 毫升冷裂解缓冲液。将肝脏置于培养皿中。

使用刀具分离 200 至 500 毫克的肝组织块，并转移至聚四氟乙烯（PTFE）玻璃管中。将剩余的肝组织放入预冷的微量离心管中，并在液氮中速冻。使用电动匀浆器对样品进行匀浆，起始转速为 300 转/分钟，至少研磨五次，以从肝组织结构中解离肝细胞。

每次降低玻璃管时，保持研杵位于液面以下，以防止通气导致蛋白质变性。然后将转速提高至900 rpm，对肝组织进行充分匀浆，至少完成12个完整的往复行程。

将裂解液转移至已标记且预冷的离心管中，每管裂解液不超过1毫升。为开始核裂解，将肝脏裂解液在4°C下以2,000 × g离心10分钟，然后将上清液转移至冰上预冷的新微量离心管中。向冰上的微量离心管中加入相当于上清液体积1/9的10% NP-40，并通过轻轻颠倒离心管混合溶液。

使用小型离心机快速离心微离心管，然后加入相当于样品体积1/9的10% DOC。通过轻轻倒置微离心管进行混匀，再次快速离心，并在冰上孵育5分钟。在4°C条件下以20,000 × g离心核裂解液10分钟，随后将上清液转移至预冷的新的微离心管中，置于冰上。

对于每个离心管，取上清液总体积的1%作为免疫沉淀前对照。将免疫沉淀前对照置于4°C条件下，在旋转仪上孵育过夜。使用移液器轻柔地重悬亲和介质，务必小心操作，然后向每个样品中加入200 µL。

将裂解液在4°C下于试管旋转仪上轻轻混匀，孵育过夜。为分离RNA，先在小型离心机中短暂离心含有裂解液的试管，然后将试管置于磁力架上至少一分钟以收集磁珠。将上清液转移至新的微量离心管中。

向每根试管中加入一毫升新鲜的高盐缓冲液，然后轻轻吹打至少五次，避免产生气泡。将试管置于冰上的磁力架上静置超过一分钟，使磁珠聚集，然后移除上清液。重复洗涤步骤另外四次。

然后，将微量离心管从磁力架上取下，在室温下放置五分钟以升温。加入100 µL裂解缓冲液和0.7 µL β-巯基乙醇，重悬磁珠，以从亲和基质中释放结合的RNA。在最高转速下涡旋振荡管子至少五秒钟，并迅速离心。

然后，将离心管在室温下孵育10分钟。将离心管置于磁力架上至少1分钟，收集上清液，并立即按照试剂盒中的RNA纯化方案进行RNA纯化。为获得最高质量的分离RNA，需执行所有可选步骤，包括DNase消化以及所有RNA洗脱步骤，包括建议将洗脱缓冲液预热至60摄氏度。

本研究中，通过水动力注射法将含有GFP-L10A融合基因和Fah转基因的转座子质粒捕获载体共同递送至肝脏。撤除尼替西农后，诱导产生肝脏毒性损伤。免疫荧光染色证实，在肝脏细胞重建两周后，FAH与GFP-L10A融合蛋白共表达，并观察到再生的肝细胞。

静息状态的样本产生了最高的融合蛋白产量，因为所有肝细胞在注射 AAV8-TBG-Cre 后均表达 GFP-L10A。相反，在不含 GFP-L10A 转基因的野生型对照组中几乎检测不到 RNA，表明 TRAP 实验流程具有高度特异性且背景信号低。当 TRAP 应用于正在由转导了 GFP-L10A 的肝细胞进行再增殖的肝组织时，获得了大量高质量的 RNA。

相比之下，通过Bioanalyzer在阴性对照样本中未检测到RNA条带。与静息状态的肝细胞相比，增殖肝细胞中Gsta1的表达水平诱导上升了十倍以上，而由于缺乏输入RNA，从野生型小鼠经TRAP分离的RNA未检测到阈值循环值。在匀浆组织时，务必缓慢移动研杵，以防止产生气泡。

在分离RNA后，可进行高通量测序或qPCR以分析基因表达。通过TRAP-seq技术，我们现在能够特异性地分离出再增殖肝细胞中的RNA，并分析肝脏再增殖过程中基因表达的变化。这使我们能够鉴定在此过程中发生改变的基因，以及治疗肝损伤的潜在治疗靶点。

环己酰亚胺和DTT存在于多种缓冲液中，二者均有毒性。废弃物应根据机构规定进行收集和处理。