通过心脏毒素损伤及体内自递送siRNA注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

该技术可结合使用蛇毒心脏毒素的肌肉注射与自递送siRNA的肌肉注射，从而实现对骨骼肌再生过程的分析。应用自递送siRNA是一种研究单个基因在肌肉再生过程中功能缺失的巧妙方法，可避免使用转基因动物。在确认动物对足趾夹捏无反应后，剃除从膝关节至足掌的前肢下段注射区域的毛发，并清除所有松散的毛发。

将小鼠仰卧置于覆盖无菌手术布的头部垫上，使用70%乙醇消毒颅侧小腿的注射区域。随后，用胰岛素注射器（配备29号针头）吸取50 µL 20 µmol的肌毒素，将针头完全刺入膝盖远端的肌肉内。针头到位后，在10至20秒的给药时间内，边缓慢前后移动针头边沿肌肉全长注射肌毒素，以确保肌毒素均匀分布，从而损伤整块胫骨前肌。

然后将小鼠放回垫有加热垫的笼子中，并进行监测，直至其完全恢复仰卧状态。手术后第3天，按上述方法对注射区域进行消毒。按照上述方法，向麻醉小鼠的胫骨前肌注射不超过50 µL的针对目标基因的siRNA。

然后将小鼠放回笼中，并监测直至完全仰卧。在采集受损肌肉组织前，用铝箔包裹一支铅笔，并用胶带密封铅笔，使模具底部形成平整且封闭的表面。模具准备好后，用70%乙醇对整个动物体表进行消毒，并使用超锐利剪刀去除踝部皮肤。

在取材肌肉之前，用精细镊子夹住受伤腿踝部胫骨旁的筋膜处已闭合的镊子，向膝关节方向移动镊子以撕开筋膜，暴露胫骨前肌。为分离胫骨前肌，需先暴露其远端肌腱，并用精细镊子夹住该肌腱。使用弹簧剪剪断肌腱，然后在肌腱处夹住肌肉，将肌肉向膝关节方向牵拉。

为了便于分析肌腹区域，使用直剪刀在胫骨前肌的肌腹部位将其切成大小相等的两半，并用冷冻液将铅笔模具填充至一半。将胫骨前肌的两半组织垂直放入冷冻模具中，使肌腹区域朝向模具底部。用镊子将装有组织的冷冻模具半浸入液氮中。

当冷冻介质由透明变为白色并完全凝固后，将冷冻模具转移至-80摄氏度冰箱或干冰中，以备后续处理。在对照肌肉组织中，组织结构保持完整，表现为细胞核位于肌纤维周边，间质区域无单核细胞聚集。心脏毒素介导损伤7天后，出现新的肌纤维，其特征是细胞核位于中央，同时伴有单核细胞聚集，这些细胞主要为卫星细胞，也包括免疫细胞等非肌源性细胞。

在静息状态下，以红色标记的 Pax7 染色所示，卫星细胞位于绿色显示的基底膜下方。损伤后 3 天，卫星细胞数量增加，且卫星细胞不再位于基底膜下方。损伤后第 10 天，卫星细胞数量仍然增加。

为了进一步分析再生过程，可使用针对发育型肌球蛋白的抗体对新形成的肌纤维进行染色。在注射siRNA后两天，可检测卫星细胞中是否存在荧光标记的siRNA。在此项代表性实验中，再生肌肉中约75%的卫星细胞对荧光标记的siRNA呈阳性反应。

此外，约74%的再生肌纤维也对荧光标记的siRNA呈阳性，这表明要么是74%的再生肌纤维摄取了siRNA，要么是siRNA阳性的卫星细胞相互融合形成了新的肌纤维，或者与已存在的再生肌纤维发生了融合。最关键的步骤是实现胫骨前肌的完全损伤。除了组织学分析外，还可记录如肌肉产生的力量等参数，以功能性方式分析骨骼肌的再生情况。