使用荧光原位杂交技术在小鼠胃肠道中可视化 Candida albicans

该方案为我们迄今为止理解白色念珠菌如何定植于哺乳动物胃肠道提供了部分最佳见解。例如，直到最近，我们尚不清楚白色念珠菌在肠道内的具体定位，也不了解其众多形态形式中哪一种存在于这一生态位中。该技术的主要优势在于，它能够在不破坏真菌与宿主结构或与微生物群中细菌之间三维相互作用的前提下，实现对白色念珠菌在其自然环境中的可视化观察。

由于肠道环境十分复杂，在实验室中对其进行建模非常困难，因此能够找到一种直接在宿主模型中研究白色念珠菌生物学特性的方法令人十分满意。包括白色念珠菌（Candida albicans）在内的某些肠道微生物组分被认为可能在炎症性肠病等疾病中发挥作用。该技术有望用于诊断从患者获取的活检标本中特定微生物的存在。

掌握灌胃技术和在不撕裂器官的情况下解剖胃肠道节段的能力，对于获得最佳实验结果至关重要。首先，根据计算出的剂量，对每只动物进行指定接种物的灌胃。将已灭菌的动物喂食针头连接至1毫升注射器，并用注射器吸取一次灌胃所需的体积，确保排尽所有气泡。

将注射器置于无菌表面。固定动物时，用惯用手抓住动物尾根部，用非惯用手沿动物背部向前滑动，捏住耳后方的松弛皮肤。用拇指和食指将颈背部皮肤紧紧捏成一撮。

用一只手抓住动物颈背部的皮肤，将其翻转，并用同一只手的小指勾住尾巴，使动物固定在手掌中。轻轻拉伸动物头部，使其与身体呈一条直线。然后用惯用手拿起注射器，将其垂直于动物身体持握，弯曲的针头朝下。

使用针头的球状端轻轻钩住口腔内侧的角落，沿口腔侧壁将针头推进至咽喉后部，然后将针头移至中央位置。当针头球端到达动物咽喉后部时，将针头向上倾斜，使其与动物身体的轴线平行，并使其顺滑地滑入食道。如果针头无法顺利滑入咽喉，可能是位置不当，应撤回针头，重新调整位置后再尝试。

轻柔推进针头，使动物将针头吞入，直至仅剩几毫米可见。通过轻轻推动推杆来检测针头球部是否位于胃内，若无阻力，继续注入接种物。接种物注射完毕后，缓慢拔出针头，并将动物放回笼中。

继续观察动物5到10分钟，注意是否有呼吸困难或痛苦的迹象，并确认其在灌胃后不久恢复正常的活动状态。如果下一动物将使用相同的接种物，请用酒精棉片清洁针头。如果使用不同的接种物，则应更换针头。

使用钝头镊子夹住腹部皮肤的一段，用剪刀在靠近骨盆底部处切开皮肤及皮下筋膜。沿腹膜腔两侧呈U形向上延伸切口至肋骨区域，然后将皮肤掀开暴露术野。用钝头镊子轻轻夹住盲肠并将其从腹膜腔中拉出，同时使用剪刀切断盲肠与小肠及大肠之间的连接组织。

将整个盲肠放入组织学包埋盒中，确保其未扭曲并平铺放置。在上方放置第二块泡沫垫，然后盖上包埋盒。随后将包埋盒放入装有甲醇-卡诺固定液（methacarn）的螺旋盖瓶中。

切除含有一个至两个粪便颗粒且长度小于包埋盒的大肠节段。将组织放入包埋盒中，保持其平整且无扭曲。覆盖第二块泡沫垫，盖上包埋盒，并将其置于甲醇-乙酸-乙醇固定液（methacarn）中。

对于需要取样的每一段小肠，切除包含部分消化物的1至2厘米肠段。将组织放入包埋盒中，覆盖第二块泡沫垫，盖上包埋盒盖子，并将其置于甲醇-乙酸固定液（methacarn）中。切除胃时，需切断其与食管和小肠的连接。

将组织放入包埋盒中，并将包埋盒置于甲醇-氯仿-乙酸固定液（methacarn）中。室温下在固定液中浸泡至少三小时，但不超过两周。固定完成后，取出泡沫垫，并将每块完整的组织切片放回其对应的包埋盒中。

然后用100%甲醇清洗组织两次，每次35分钟；再用100%乙醇清洗两次，每次25分钟；最后用二甲苯清洗两次，每次20分钟。将包埋盒在纸巾上轻轻吸干，放入预熔的石蜡中，在70摄氏度的杂交炉中孵育两小时。随后将包埋盒从石蜡中取出，让多余的石蜡流尽，并在室温下保存，直至包埋于石蜡块中。

将载玻片插入盛有二甲苯的预热容器中，以脱去石蜡包埋的组织切片中的石蜡。在60摄氏度下孵育10分钟，然后弃去二甲苯溶液。向容器中加入新鲜的室温二甲苯，重复孵育步骤。

然后用100%乙醇充满容器，并在室温下孵育5分钟。孵育结束后，将玻片从容器中取出，空气干燥。为了用FISH探针对白色念珠菌（C.albicans）进行染色，首先使用Pat Pen在组织切片周围画一个圆圈。

用移液器吸取50 µL含有杂交液的探针，滴加到固定组织上，并用移液器吸头轻轻铺匀。用杂交盖玻片覆盖液体，注意避免产生气泡。然后将切片密封于防水的杂交盒中，在杂交炉内避光、50 °C条件下孵育3小时。

孵育结束后，将洗涤液加入考普林罐中。用镊子小心地从载玻片上取下盖玻片，并将载玻片放入洗涤液中。用铝箔覆盖罐子，在50摄氏度下孵育20分钟。

接着，倒出清洗液，向玻片缸中重新加入 PBS 进行清洗。立即倒掉 PBS 并更换新鲜 PBS，重复此步骤，共清洗两次。用无尘擦拭纸吸去 PBS，然后用防水标记笔在肠组织切片周围画圈。

将切片放入不透明的塑料容器中，并向组织切片区加入50微升黏蛋白核染色液。用铝箔覆盖容器，在4摄氏度下孵育45分钟。孵育结束后，将切片放入考普林瓶中，用PBS洗涤两次。

用纸巾轻轻吸去多余的 PBS，再用擦镜纸吸走最后的液滴。在每个样本上滴加一滴封片剂，盖上玻璃盖玻片，注意避免产生气泡。让封片剂在盖玻片下充分展开。

用指甲油在盖玻片四角固定，然后使用荧光显微镜观察载玻片。该方案可用于在体外及宿主组织中对白色念珠菌（C. albicans）进行荧光标记。体外培养的菌丝、圆形酵母细胞、肠道细胞以及不透明细胞经固定、通透处理后，通过荧光显微镜和相差显微镜加以区分。

在小鼠大肠中观察到圆形酵母细胞和高度伸长的菌丝。宿主组织使用针对白色念珠菌的特异性探针或广谱真菌探针进行染色。白色念珠菌呈红色，宿主细胞核呈蓝色，黏液层呈绿色。

在小鼠胃肠道的不同节段中均检测到白色念珠菌，包括紧邻宿主黏膜的区域以及肠道管腔更中央的区域。对于此前未进行过灌胃操作的科研人员而言，在尝试该方法前接受专门培训至关重要。在完成鱼类染色后，可采用免疫荧光技术对宿主黏膜的其他特征进行染色。

这有助于表征宿主的组织损伤或免疫反应。该技术使我们能够进一步阐明白色念珠菌突变体的真菌细胞形态与在宿主体内存活能力之间的关系，从而加深对白色念珠菌生物学的理解，在开发治疗策略时可加以利用。