通过荧光技术可视化肠道微生物群-宿主相互作用 原位 杂交、凝集素染色与成像

与宿主相关的微生物构成了一个极为复杂的生态系统，必须通过成像手段才能加以理解。在本视频中，我们将向您展示如何完成染色过程，实现对宿主与微生物组界面的可视化观察。要理解宿主相关细菌的生物学特性，必须了解它们在微环境中的定位情况。

该技术将使我们能够在宿主环境中以及与其他细菌共存的情况下，观察特定的分类单元。通过该技术，可以确定哪些细菌可能已侵入宿主组织，同时也能判断宿主黏液等关键组分是否被消耗。在合适的容器中配制新鲜的甲醇-氯仿-乙酸固定液（methacarn），其中含60%的无水甲醇、30%氯仿和10%冰醋酸。

使用锋利且洁净的工具从小鼠体内切取肠段用于成像。尽量减少对样本的扰动，操作时应仅触碰组织皱褶部分，以避免影响成像区域。解剖后应尽快固定样本，防止其降解。

用镊子轻轻夹住组织边缘，将肠段放入组织学包埋盒中。盖上盒盖，并将其完全浸入新鲜的甲醇-卡诺固定液（methacarn 溶液）中，确保固定液在浸入包埋盒时不超过数小时。对于在临床环境中采集且无法使用通风橱的临床样本，应使用带有翻盖式开口的聚乙烯储存容器，翻盖上的切口应允许组织学包埋盒穿过。

不传递样本时，用胶带将此盖板封紧，以防止有毒气体逸出。将石蜡置于耐热容器中，于60摄氏度烘箱内过夜熔化。根据文稿中的描述，通过将液体倒入适当的废液容器中，并依次在无水甲醇、无水乙醇和二甲苯中孵育，对组织进行洗涤。

戴上双层手套或使用镊子，将包埋盒稍微打开，以便石蜡进入，同时防止组织片段丢失。将包埋盒浸入熔融石蜡容器中并关闭。将容器放回60°C的烘箱中，确保包埋盒完全充满石蜡，且无较大气泡残留。

孵育两小时后，将容器从烘箱中取出。使用镊子小心取出包埋盒。将烘箱加热至60摄氏度，并预热一个考普林罐。

在玻璃瓶中加入足量的二甲苯，使其能够将染色缸中的玻片完全覆盖两次，并在瓶盖周围包裹封口膜以防止二甲苯蒸发。将二甲苯温度升至60摄氏度。按照文本稿件中的说明配制FISH杂交溶液。

将切片放入 Coplin 染色缸中，确保切片之间以及切片与缸壁之间互不接触，于 60 摄氏度烘烤 10 分钟。在通风橱内，从烘箱中取出预热的二甲苯倒入 Coplin 染色缸，注意不要直接倾倒在样本上方，以免组织脱落。将 Coplin 染色缸重新放回 60 摄氏度的烘箱中。

将使用过的二甲苯倒入适当的废液容器中，注意不要扰动玻片上的组织切片，并使用镊子防止玻片从考普林瓶中滑落。用剩余的二甲苯补充考普林瓶，并在通风橱中室温孵育10分钟。将切片置于99.5%乙醇中，室温孵育5分钟。

孵育后，从染色缸中取出载玻片。用实验室擦拭纸或纸巾擦拭载玻片背面，并短暂空气干燥，直至乙醇液滴完全消失。使用液体阻断剂或PAP笔在每张组织切片周围绘制紧密的封闭圈，以限制杂交液需要覆盖的扩散区域，注意避免笔迹与组织切片接触。

配制杂交溶液，并为每使用50微升溶液加入0.5微克的探针。将溶液移液至载玻片上的切片上。用柔性塑料盖玻片覆盖切片区域，确保所用液体体积能够完全覆盖整个切片。

使用移液器吸头盒制作一个湿盒，在盒内放入已用过量杂交液或 PBS 浸湿的擦拭布或纸巾以提供湿度。将载玻片置于湿盒中，在 45 至 50 摄氏度下孵育至少三小时，具体时间根据探针组而定，以减少蒸发。移除塑料盖玻片，将载玻片放入预热至 50 摄氏度的 Coplin 染色缸中的 FISH 洗涤缓冲液中孵育。

将Coplin染色缸重新放回50摄氏度的烘箱中，孵育10至20分钟。从Coplin染色缸中移除FISH洗涤缓冲液，并用PBS替换。在Coplin染色缸中重新加入PBS后，立即倾去PBS。

从染色缸中取出载玻片，用移液器将复染液滴加至组织切片的整个区域，注意移液枪头不要接触组织。在4°C条件下孵育45分钟。用新鲜的PBS快速洗涤染色液三次。

用擦拭纸或纸巾擦拭载玻片背面，并借助连接在移液枪头上的真空管路，使大部分 PBS 从组织切片上蒸发。使用封片剂对切片进行封片。用透明指甲油沿盖玻片边缘涂抹，将盖玻片固定在载玻片上，注意避免接触载玻片的边缘。

在室温下静置。此处展示的是仅定植 Muribaculum intestinale 的小鼠以及同时定植 Muribaculum intestinale 和 Bacteroides thetaiotaomicron 的小鼠远端结肠的图像。样品使用针对 Muribaculum 分离株特异的 3' 氰基-3 标记的 FISH 探针进行染色，同时用罗丹明标记的凝集素 UEA-1 和 DAPI 进行复染。

使用花青素-3荧光原位杂交（cyanine-3 FISH）、DAPI染色以及花青素-3 FISH与DAPI合并通道染色的切片图像显示了肠道Muribaculum（Muribaculum intestinale）的定位情况。在单一定植状态下，所有呈细菌形态且大小与细菌相符的DAPI信号均被花青素-3标记。在双重定植状态下，除了这些花青素-3和DAPI双阳性细胞外，还存在DAPI染色阳性但花青素-3阴性的细菌细胞，符合预期。

除了较长的丝状细菌外，较大的DAPI阳性结构为植物材料或宿主细胞的细胞核。若肠段切片深度仅能显示隐窝的横截面，而无法观察到肠腔、上皮的纵切面、恒定的黏液层或细菌，则证明浅层切片无法获得肠道的肠腔切面。组织或盖玻片覆盖不均匀会导致平铺扫描图像模糊且照明不均。

此处还展示了正常背景与高背景的示例。随着我们对微生物群的了解不断深入，越来越明显的是，诸如测序等整体性检测方法尚不足以真正确定不同微生物物种之间发生的情况以及它们如何相互作用。为此，我们确实需要成像技术。

这类技术已促成了一些非常重要的发现，例如，饮食中缺乏纤维会导致黏液层变薄，并可能引发病原体感染，这方面的研究来自Martins课题组；此外还有关于渗透性腹泻的影响以及黏液层耗竭如何真正影响宿主和微生物群的研究，这些研究由Sonnenberg课题组以及我们课题组完成。