用于精确细胞表征与精准蛋白定位的细菌细胞三维成像

由于细菌体积微小，人们常常忽略它们实际上是三维物体。本实验方案可实现对扁平和弯曲细胞形态的精确重建。该方案仅需对标准显微镜进行轻微改造，且相关 MATLAB 脚本易于获取。

实验开始前，将三组各两叠20 × 20 毫米的盖玻片分别放置在一块载玻片的两端。用移液器吸取200 µL琼脂糖凝胶溶液滴加到载玻片上，立即并牢固地将另一块载玻片压在盖玻片堆上以压平琼脂糖。在室温下静置约1分钟使琼脂糖凝固后，小心地滑开上层载玻片，并使用200 µL移液器吸头的粗端从凝胶中切下直径为5毫米的单个凝胶垫。

当所有垫片都准备好后，用移液器反复吹打大肠杆菌细胞培养液，以打散可能存在的细胞团块，并确保细胞均匀分布，然后将1微升的菌液接种到每个垫片上。将样品在空气中干燥5至10分钟，确认液滴已完全被垫片吸收后，再将盖玻片覆盖在垫片上。随后用棉签轻轻在盖玻片边缘涂抹适量的封片剂，注意避免将封片剂沾到盖玻片的上表面。

封片后立即将载玻片置于显微镜载物台上，待热平衡5分钟后，使用显微镜的调焦旋钮将细胞中部调至焦点。在相关显微镜软件的ND采集界面中，勾选Z框以采集Z轴层扫图像，然后点击Home按钮，将细胞中部设为起始点。将步长设为0.1微米，范围设为4微米，并确保Z轴设备设置为压电载物台。

必须确保细胞的顶部和底部均有足够的模糊，使细胞几乎与背景无法区分。在lambda窗口下将荧光通道设置为所成像荧光分子的相应参数，并确认实验顺序已设为lambda模式，以便在切换通道前，每个荧光通道均能获取完整的Z轴层扫图像。然后点击“立即运行”以开始图像采集。

当所有图像采集完成后，在合适的图像分析软件中打开文件。在单个细胞周围绘制一个方框，并将该细胞复制两次，每次对应一个通道，确保勾选“复制超堆栈”（Duplicate hyperstack）选项，并将通道分别更改为通道一或通道二。当两个堆栈均可用后，选择“图像”（Images）→“堆栈”（Stacks）→“工具”（Tools）→“拼接”（Concatenate），以合并图像。

先使用蛋白通道，再使用形态通道。将新图像保存为 TIFF 文件后，在桌面上的文件夹内创建一个文件夹，其中包含裁剪后的图像以及来自 shae-cellshape-public exampleData_tri 的 cell_shape_settings_tri.txt 文件。

编辑 cell_shape_settings_tri.txt 文件，使其包含与目标实验相对应的正确设置。然后运行 Cell_shape_detector3dConvTriFolder 函数，输入参数依次为文件夹路径的字符串、起始细胞的编号以及需要运行的细胞数量。

为确认细胞已正确重建，请运行 ScreenFits。当图形用户界面打开后，点击“选择文件夹”按钮，并选择包含重建数据文件的文件夹，以直观地筛查各个细胞的重建结果。对于任何形态异常或未完全覆盖的细胞，勾选其重建文件旁的复选框，以便在文件名后添加 FLAG 标记，从而在后续分析中将其排除。

运行 enrichmentSmothingSpline 以创建目标蛋白相对浓度随表面高斯曲率变化的富集曲线图。然后选择包含刚刚生成的 TRI.mat 文件的每个文件夹，并选择新生成的曲线 mat 文件。

当处理弯曲或形状异常的细胞时，该方法尤为有用，因为二维图像无法准确反映细胞的曲率。在本实验中，构建了一种绿色荧光融合蛋白，该蛋白与细菌肌动蛋白MreB融合，用于研究肌动蛋白在野生型和突变型大肠杆菌细胞中的精确定位。通过对三维成像图像进行测量，成功重建了野生型和rodZ突变型细胞的形态。

随后确定 MreB 定位于较小的高斯曲率处，这是一种只能在三维空间中以 rodZ 依赖方式测量的几何特征。请务必确保 Z 轴堆栈足够大，使细胞在顶部和底部模糊，并且细胞之间保持良好间距。我们展示了如何在三维空间中测量蛋白质的几何定位，但也可从该数据计算其他信息，例如标签蛋白组装体的大小。