建立与分析源自前列腺癌骨转移患者样本及其异种移植瘤的三维（3D）类器官

我们介绍了建立骨转移性前列腺癌患者来源类器官三维连续培养的策略及逐步操作方案。我们优化后的方案可利用直接来自患者或患者来源异种移植瘤组织的有限起始材料，便捷地建立用于实验的三维培养体系。本方案获得的三维类器官可作为体外模型，用于研究骨转移性前列腺癌病理的基本机制以及进行治疗测试。

本方案中的3D类器官培养基专用于前列腺来源的细胞。我们方案的其他部分适用于不同类型的肿瘤组织和转移部位。封顶技术可能是该过程中最具挑战性的步骤。

练习穹顶技术可确保类器官、培养基和Matrigel混合物形成的穹顶大小一致，并在样品悬浮过程中尽量减少气泡的产生。通过直观演示该方法，有助于更好地理解如何操作黏稠的Matrigel，从而利用少量细胞成功培养低密度类器官。首先，将细胞沉淀重悬于适用于24孔板体系的适当体积的基底膜基质中。

轻轻吹打混匀，确保细胞充分重悬，然后将适量细胞悬液加入预热的组织培养板中央。将培养板倒置，并立即放入设定为37摄氏度、5%二氧化碳的细胞培养箱中，孵育15分钟。向每孔中加入含10 µM Y-27632二盐酸盐的预热培养基适量。

为了从已贴附的圆形穹顶形成一个悬浮穹顶，使用细胞刮刀将穹顶从培养板上分离。剪下一小块大小为两英寸乘四英寸的石蜡膜，并将其覆盖在1毫升塑料移液器吸头盒的空吸头架凹槽面上。戴上手套后，用食指轻轻按压石蜡膜，沿凹槽轮廓按压成型，注意不要刺破薄膜。

用70%乙醇喷洒石蜡膜，并打开细胞培养罩内的紫外灯，对制备好的膜至少消毒30分钟。同时，将预处理的细胞重悬于20 µL基底膜中。然后将悬液移入石蜡膜上形成的凹坑中。

将凝固的凝胶珠和石蜡膜放入六孔板中，用移液器向每孔加入三到五毫升含有10微摩尔Y-27632二盐酸盐的预温培养基，同时轻轻刷下石蜡膜上的凝胶珠。为进行组织学处理，小心吸除孔中现有培养基，注意避免吸走基底膜凝胶滴。加入等体积的细胞回收溶液，将六孔板在4摄氏度下孵育60分钟。

孵育结束后，用移液器松动基底膜穹顶，并用移液器吸头将其压碎。收集解离的穹顶及细胞回收液至1.5毫升离心管中。在4°C下以300 × g离心5分钟，然后弃去上清液并保留备用。

将所有上清液保存至最后一步，当在预期体积的冷PBS中确认类器官存在后，轻轻吹打混匀，通过机械方式使沉淀物脱离，同时避免破坏类器官。重复离心并移除上清液。用等体积的4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定沉淀物60分钟。

固定后，重复离心步骤及 PBS 洗涤。然后缓慢加入 200 µL 温热的 2% 琼脂糖，并立即使用连接在 1 mL 注射器上的 25 号针头轻轻将细胞沉淀从管壁上脱离，注意不要破坏沉淀。对于琼脂糖离心法，加入琼脂糖后立即用 25 号针头将细胞沉淀从管壁上脱离至关重要。

待琼脂糖完全凝固后，用连接在1毫升注射器上的25号针头将其从管中剥离，并转移至新的1.5毫升离心管中。加入70%乙醇充满管体，随后按照常规组织脱水与石蜡包埋流程进行操作。该方案已成功用于建立来源于骨转移性前列腺癌患者异种移植模型的三维类器官，也可直接从癌组织中建立类器官。

类器官表现出不同的表型，表现为囊状结构、球状体以及更复杂的类器官结构。通过25张高分辨率、10倍放大图像拼接而成的图像，可以观察到完整的基底膜穹顶结构及其中的类器官。为进一步研究肿瘤组织，对厚度为五微米的类器官石蜡切片进行了免疫荧光细胞化学染色，靶标分别为基底上皮细胞标志物细胞角蛋白-5、腔面上皮细胞标志物细胞角蛋白-8以及DAPI。

该方案可优化用于其他应用，如蛋白质印迹、共培养和流式细胞术，以研究三维类器官的特性及药物处理的效果。这些实验可用于探讨药物耐药机制，以及新型治疗药物单独使用或与现有疗法联合使用时的疗效。该技术获得的三维类器官保留了个体间和个体内的异质性，因此更能准确模拟患者中的疾病状态。

该技术为研究人员探索药物耐药性、肿瘤发生、转移及治疗机制提供了新途径，这些研究可能更准确地预测患者的疾病进展及其对治疗的反应。