利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

与传统的细胞培养相比，小鼠类器官培养更接近体内细胞的组织结构。在癌症研究中，类器官比二维细胞系更能准确模拟原始肿瘤，可用于体外测试潜在的癌症治疗方法，从而开发新的药物治疗方案。为完整取出雄性小鼠泌尿生殖系统，应抓住膀胱两侧的脂肪垫，向上牵拉以暴露睾丸。

小心地将每侧睾丸从其余泌尿生殖区域分离。轻轻抬起膀胱，使泌尿生殖区域随之抬高，暴露下方的尿道。在固定膀胱的同时，将剪刀置于背侧前列腺的下方，以切开尿道。

将整个泌尿生殖区域从腹腔中游离出来。在移除泌尿生殖系统后，位于其后方、紧邻脊柱两侧的盆腔淋巴结将暴露出来。为切除淋巴结，需将直血管钳置于淋巴组织下方，向上提起。

接下来，用直止血钳夹住直肠并剪断，向上牵拉直肠以充分展开整个结肠和小肠，观察肠系膜淋巴结是否存在转移性病灶。当整个回肠被完全切除后，继续牵拉十二指肠以暴露胃部。剪断食管，从而完整移除胃。

若观察到淋巴结中存在任何转移性病灶，应小心将这些淋巴结从肠组织分离，并置于 PBS 中保存。胃切除后，可从腹腔背侧取脾脏，置于 4% 多聚甲醛中保存。将肝脏取出后置于 PBS 中保存。

将双侧脊柱旁的肾脏以及含有转移性病灶的肾周淋巴结一并切除。为暴露胸腔，需沿肋骨边缘小心切开膈肌。胸腔内负压释放后，即可暴露心脏和肺组织。

上提胸骨以进一步打开胸腔。沿肋骨观察胸腔腹侧面，检查胸腔淋巴结是否存在转移性病灶，如有则进行解剖。在仍保持提起胸骨的同时，剪除腹侧肋骨以暴露心脏和肺，并上提心脏，从肺下方进行剪切。

为了完整地整块切除心脏和肺，需在气管处切断所有前方的血管。小心地将心脏转移至一容器内的磷酸盐缓冲液（PBS）中，注意避免损伤肺组织或肺转移病灶。如需解剖前列腺肿瘤，应将泌尿生殖区域置于解剖显微镜下进行操作。

使用一对直镊和一对弯镊将泌尿生殖区域翻转至背侧。找到前列腺近端区域，该区域可通过尿道的粉红色至红色来识别。牢固夹住尿道，以便用弯镊操作泌尿生殖组织。

定位精囊的基底部，以便小心将其去除。然后使用镊子的弯曲侧去除输精管以及尽可能多的脂肪和结缔组织。在牢固夹住尿道及前列腺近端区域的同时，使用一把精细的尖头剪刀将膀胱从尿道上剪下。

用直镊子牢固夹住前列腺近端区域和尿道，再用镊子的弯曲侧夹住前列腺前部区域，用力将组织从膀胱及其他前列腺组织中拉出。将前列腺前部组织置于 PBS 中，并定位腹侧前列腺区域。以相同方式分离腹侧前列腺区域。

如果能够区分侧叶与背叶，则切除双侧的前列腺侧叶组织。随后切除背侧前列腺组织，并将前列腺近端组织置于4%多聚甲醛中固定。将组织剪碎后，将肿瘤组织块放入含有15毫升消化缓冲液的离心管中，在37摄氏度条件下消化1.5至2小时。

消化结束后，通过离心沉淀消化后的组织，并弃去上清液。轻弹离心管以松散细胞沉淀。将细胞重悬于1毫升预热的胰蛋白酶中，其中添加10 µM Y-27632 ROCK抑制剂，在37°C孵育5分钟。

孵育结束后，使用标准的 P1000 移液器吸头将组织悬液吹打 5 次。将离心管放回水浴中，继续孵育并吹打 5 分钟。对于基质胶圆顶状包埋培养，用 9 毫升冷培养基洗涤消化后的细胞，然后通过离心收集细胞。

用一毫升新鲜培养基重悬细胞，进行计数。计数后，再次通过离心收集细胞。将肿瘤细胞稀释于适当体积的基质中。

将200微升基质细胞溶液小心地滴加到预热至55摄氏度的六孔板的每个孔中。室温下静置2分钟，使液滴形成圆顶状并凝固，然后将板倒置于37摄氏度培养箱中孵育20分钟。当圆顶完全凝固后，向每孔加入2毫升前列腺类器官培养基，培养基中需添加雄激素R1881和ROCK抑制剂。

将培养板放回细胞培养箱中。荧光解剖图像显示前列腺实体瘤表达绿色荧光蛋白（GFP），表明肿瘤细胞表达了Cre。同一动物的肝脏和肺组织中也观察到表达GFP的转移性肿瘤，证明这些转移瘤起源于原发性前列腺肿瘤。

该小鼠的盆腔淋巴结表达GFP而不表达Tomato，表明转移性肿瘤已完全占据淋巴结，无正常组织残留。在培养的第一天，由实体前列腺肿瘤生成的小类器官开始形成，肿瘤类器官培养物中同时存在表达Tomato和GFP的细胞。然而，到培养第七天及之后，当前列腺肿瘤类器官完全形成时，类器官表达GFP但不表达Tomato，提示这些类器官来源于表达Cre的肿瘤细胞，而非正常上皮细胞。

在由充满液体的前列腺肿瘤生成的小类器官培养的第一天，类器官培养物中同时存在表达Tomato和GFP的细胞。然而，在第7天及之后，来自充满液体的前列腺肿瘤的类器官仅表达GFP或Tomato，这表明这些类器官是由不表达Cre的细胞形成的。在收获前列腺组织时，为保持方向感，应始终注意膀胱和尿道的位置。

类器官生成后，可用于成像应用、分子生物学分析和药物筛选。