利用酵母毒性及抑制子筛选鉴定细菌效应蛋白靶向的宿主通路

胞内细菌会向宿主细胞分泌效应蛋白，这些蛋白可操控宿主的生物学通路，以促进病原体的存活。揭示效应蛋白的宿主靶点对于理解沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）等胞内病原体至关重要。酵母毒性及抑制子筛选可为细菌效应蛋白的天然生物学靶点提供关键线索，尤其在尚未明确其结合伴侣的情况下，这类方法尤为有用。

本文以酵母毒性及抑制子筛选实验为例，展示其在筛选沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）效应蛋白中的应用，但该技术也已被用于军团菌（Legionella pneumophila）和贝氏柯克斯体（Coxiella burnetii）效应蛋白的功能表征。首先，取单个转化了含效应蛋白质粒的酵母菌落，接种于5 mL单缺培养基中。以仅含空载体的转化酵母作为阴性对照，于30°C条件下振荡培养过夜。

第二天，向96孔板的A2至A6孔中各加入180微升无菌水。涡旋振荡过夜培养物，并向A1孔中加入180微升酵母。随后用无菌水在各孔中对酵母进行连续稀释。使用多通道移液器将每种稀释液各5微升点样至单缺葡萄糖和单缺半乳糖琼脂平板上，于30摄氏度培养48小时。

孵育结束后，通过比较在含半乳糖培养基上表达效应蛋白的酵母与仅表达空载体的酵母的生长情况，目视评估毒性。取100毫升单缺培养液，接种1毫升先前制备的酵母菌种，于30°C、150 RPM振荡条件下孵育16至24小时。次日，将100毫升过夜培养物全部加入900毫升预热的单缺培养液中，于30°C振荡培养4至5小时。

孵育结束后，在 4 摄氏度下以 6,000 × g 离心 10 分钟，收集菌体沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于 250 毫升无菌水中。重复离心操作，弃去上清液。

然后将沉淀重悬于250毫升1毫摩尔乙酸锂溶液中。通过离心收集菌体沉淀，弃去乙酸锂溶液，再将沉淀重悬于9.6毫升50% PEG 3350溶液中。随后加入文中所述的转化试剂，并用无菌水轻轻颠倒混匀，调节总体积至15毫升。

将混合物在30摄氏度下孵育30分钟。然后加入750 µL DMSO，并在42摄氏度水浴中继续孵育30分钟。在热激前加入DMSO对于获得高转化效率至关重要。

孵育结束后，以3,000 × g离心5分钟收集酵母菌体。弃去上清液，用10毫升无菌水洗涤菌体沉淀，然后再次离心以收集酵母菌体。将菌体沉淀重悬于8毫升水中。

通过将样品稀释十倍后，取每种稀释液100微升涂布于双缺落琼脂平板上，以测定转化效率。然后取200微升样品涂布于双缺落半乳糖琼脂平板上，于30摄氏度培养48至96小时，或直至菌落出现。菌落出现后，将其转接到双缺落半乳糖琼脂平板上，并继续培养24至48小时。

取部分菌块接种于5毫升双缺培养液中，26摄氏度、150转/分钟振荡培养过夜。次日，向96孔板的五个孔（从A2孔开始）各加入180微升无菌水。将过夜培养物充分涡旋混匀，取180微升酵母菌液加入A1孔，利用A2至A6孔中的无菌水进行连续梯度稀释。将各稀释液分别取5微升点样于单缺葡萄糖和单缺半乳糖琼脂平板，注意同时设置仅含毒性效应物的对照组。

将平板在30摄氏度下孵育48小时，然后将仅含毒性效应因子的酵母生长情况与含有潜在抑制因子的酵母生长情况进行比较。对于相较于单独毒性效应因子表现出毒性减弱的候选抑制因子，按照论文中的指示提取质粒，并重新转化至毒性酵母中。从转化平板上挑取单菌落，接种于双缺失葡萄糖液体培养基中。

37℃过夜培养，并点种于双缺葡萄糖和半乳糖琼脂平板上，以确认毒性被抑制。在进行酵母抑制子筛选之前，需先检测目的效应蛋白在酵母中的毒性。将目的蛋白在半乳糖诱导型启动子的控制下于酵母中表达，比较其在半乳糖培养基与葡萄糖培养基中的生长情况。

在检测CT229的毒性时，观察到菌落变小且生长受到抑制。理想情况下，应观察到2至3个数量级的下降，方可进行酵母抑制子筛选。抑制子筛选通过将有毒性菌株转化入酵母基因组文库pYAP 13，并将转化子接种至半乳糖琼脂平板上进行。

将获得的抑制子克隆点种于双缺失半乳糖琼脂培养基上，以确认其对毒性的抑制作用。其中，pSup1 和 pSup2 能够抑制效应蛋白的毒性，而 pSup3 则不能。这些实验步骤不仅需要细致的操作，还需进行关键的前期准备工作，包括在实验开始前准备好大量培养基和培养板。

一旦鉴定出抑制因子，即可开展实验以验证其与目标效应蛋白的相互作用，包括下拉实验、免疫荧光共定位、效应蛋白敲除或对筛选中鉴定出的宿主因子进行敲减。该技术在衣原体效应蛋白研究中的应用，使得效应蛋白的初步表征得以快速完成，并有助于我们将研究重点集中于阐明介导宿主-病原体相互作用的潜在分子机制。