基于交配的酵母过表达文库筛选

该方法有助于解答神经退行性疾病领域中的关键问题，例如哪些遗传因素和通路调控与疾病相关蛋白的毒性。该技术的主要优势在于利用酵母交配的高效过程，对大量文库基因构建的酵母模型进行筛选。尽管该方法可用于研究神经退行性疾病相关蛋白的毒性，也可应用于酵母中其他细胞过程的研究，例如对其他应激条件的耐受性。

首先，从阵列式质粒文库中将质粒DNA按每孔5 µL分装至96孔圆底板中，并将该板置于4 °C保存。接着，在500 mL三角瓶中加入150 mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基，并接种单个单倍体酵母菌株W303 Alpha的菌落。

将培养物在30摄氏度、200 rpm振荡条件下过夜培养。次日早晨，测定过夜培养物的OD600后，将培养物稀释至OD600为0.1，总体积为两升YPD培养基。在30摄氏度、200 rpm振荡条件下继续培养约五小时，直至培养物的OD600达到0.4至0.6。

为收获酵母培养物，请将八个无菌的250毫升离心瓶装满，并在室温下以3000 ×g离心10分钟。倾去上清液，注意不要扰动沉淀。按照文本方案中所述方法洗涤酵母，并将细胞合并至两个离心管中。

将每份细胞沉淀重悬于25毫升0.1摩尔的醋酸锂溶液中。混合重悬的细胞，加入5毫升鲑鱼精子DNA，转移至150毫升锥形瓶中。在30摄氏度、225转/分钟振荡条件下孵育30分钟。

30 分钟后，将细胞混合物倒入无菌一次性试剂储液槽中。使用多通道移液器，将 35 µL 细胞混合物转移至含有先前制备的文库质粒 DNA 的 96 孔圆底培养板的每个孔中。以 1000 rpm 涡旋振荡 96 孔板 1 分钟。

将培养板置于30摄氏度条件下静置孵育30分钟。切勿叠放培养板，以利于热量更高效传递。从30摄氏度培养箱中取出96孔板，以1000 rpm速度振荡混匀30秒。

向每个孔中加入125微升转化缓冲液，然后以1000 rpm的速度涡旋振荡平板1分钟。将平板在30摄氏度下孵育30分钟。随后通过将平板置于42摄氏度的培养箱中15分钟对酵母进行热激处理。

将培养板在3000 ×g条件下离心5分钟。将培养板倒置在废液桶上方，用力倾倒以去除孔中的转化缓冲液。将倒置的培养板迅速在干净的纸巾上轻拍，以去除板表面残留的液体。

用与文库质粒上筛选标记相对应的200微升基本缺失培养基冲洗各孔细胞，此处使用合成尿嘧啶缺失培养基。以3000 ×g离心平板5分钟。

将上清液弃入废液桶中，操作方法如前所述。向每个孔中加入160 µL含有2%葡萄糖的尿嘧啶缺陷基本培养基，并以1000 rpm涡旋振荡平板1分钟。将平板置于30 °C条件下静置培养48小时。

48 小时后，每个孔底部应可见转化酵母的沉淀。使用液体分配器，向一组新的 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 含葡萄糖的尿嘧啶缺陷培养基。将含有转化酵母的板在 1000 rpm 条件下涡旋振荡 30 秒。

使用无菌的96针塑料复制器，将针插入含有转化后酵母的孔中，然后将其接种到装有培养基的新培养板的相应孔中。将新培养板在30°C下孵育24小时。24小时后，每个成功转化的酵母孔底部应可见酵母沉淀。

为将这些酵母菌株保存为甘油菌种，向每个孔中加入 50 微升 50% 甘油，以 1000 转/分钟涡旋振荡 30 秒，用铝箔密封培养板，并在 -80 摄氏度下冷冻保存。为从甘油菌种中复苏文库菌株，将 96 孔板从 -80 摄氏度冰箱中取出，移除铝箔，让酵母在室温下解冻约 30 分钟。酵母完全解冻后，使用无菌的 96 针塑料复制器将甘油菌种接种至另一块 96 孔板中含 2% 葡萄糖的 160 微升新鲜尿嘧啶缺陷型培养基（ura minus media）中，并在 30 摄氏度下培养 24 小时。

使用文库菌株后，立即密封培养板，并将其放回负80摄氏度冰箱中。在解冻文库菌株的当天，将待测酵母菌株接种于50毫升YPD培养基中，于30摄氏度、250 rpm振荡条件下过夜培养。次日早晨，将待测酵母菌株倒入无菌一次性试剂储液槽中，并向96孔板的每个孔中分装160微升待测菌液。

使用液体分配器，将YPD培养基以每孔160 µL的量加入96孔板中。轻轻涡旋混匀含有查询菌株和文库菌株的96孔板，然后使用无菌的96针复制器，将文库菌株转移至已接种查询菌株的YPD平板上。将YPD平板在30 °C条件下孵育24小时。

24 小时后，每个孔底部将可见酵母沉淀。用含有 2% 棉子糖的最小dropout培养基填充96孔板，该培养基应含有与查询菌株质粒以及文库质粒上的选择标记相对应的选择性标记。使用无菌的96针复制器将酵母从YPD交配培养物转移到选择性培养基中。

将96孔板在30摄氏度下孵育48小时。只有发生交配并形成二倍体细胞、因而同时含有诱饵质粒和文库质粒的酵母细胞才能在此培养基中生长。在含棉子糖的选择性培养基中培养48小时后，可观察到含有二倍体细胞的孔底部出现可见的沉淀。

将96孔板在1000 rpm下涡旋震荡1分钟。使用机器人点样仪将酵母以四重复的方式点样到含有2%半乳糖和2%琼脂的ura-his-缺失培养基平板上，以及含有2%葡萄糖和2%琼脂的ura-his-缺失培养基平板上。点样后，让琼脂平板干燥，然后倒置放入30°C培养箱中培养四天。

每24小时拍摄一次琼脂平板照片，以记录酵母的生长情况。首先在二倍体酵母中检测了与肌萎缩侧索硬化（ALS）相关的蛋白FUS的毒性。如含有可诱导FUS表达的半乳糖的琼脂平板所示，FUS的毒性在二倍体和单倍体酵母中均表现一致。

通过交配法检测了先前利用基于转化的方法鉴定出的五个抑制FUS毒性的基因。第一泳道为携带两个空载体的对照酵母菌株。第二泳道为携带空载体的二倍体FUS酵母菌株，其中FUS的表达具有很强的毒性。

第3至第7泳道显示表达FUS以及一种抑制基因的二倍体酵母。这五个基因均能挽救FUS在二倍体酵母中的毒性，表明交配方法是有效的。随后，该基于交配的方法被应用于包含940个基因的过表达文库筛选。

展示了一块代表性平板的照片。如半乳糖平板所示，在表达 FUS 和文库基因的条件下，FUS 对二倍体酵母细胞具有毒性。由绿色方块标示的文库基因能够挽救 FUS 的毒性。

尽管文库基因（以红色方块表示）增强了毒性。一旦掌握，该技术可在120小时内完成，前提是操作正确。在进行该实验时，重要的是要提前确认用于筛选的表型不依赖于单倍体交配型。

观看本视频后，您应能够充分理解如何鉴定在酵母中过表达时可缓解疾病相关蛋白毒性的遗传因子。该技术建立后，可为神经退行性疾病领域的研究人员探索疾病相关蛋白在酵母模型中的细胞毒性机制提供新的途径。在完成本实验步骤后，还可进一步开展其他方法，例如β-半乳糖苷酶活性检测，以回答更多问题，如该缓解效应是否具有特异性。