一种非侵入性激光辅助角膜内皮细胞丢失实验模型的建立

目前关于角膜内皮细胞丢失的疾病模型主要集中在内皮层的破坏，更可能代表了疾病终末阶段，此时角膜移植不可避免。然而，现已出现利用干细胞或基因治疗等新疗法，可能对疾病早期阶段更为有效，但针对这些早期阶段的模型尚属缺乏。使用Nd:YAG激光通过光致破裂进行的无创眼内手术，已成为眼科医生的常规操作。

从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼后，将样品置于4°C的完全培养基中。使用剪刀去除细胞外组织，并将眼球浸泡在5%聚维酮碘眼用溶液中5分钟。随后，将消毒后的样品置于室温下的无菌PBS中。

使用谱域光学相干断层扫描仪对眼部进行检查，筛查角膜瘢痕、水肿及其他前节主要病变等异常情况。完成筛查后，将眼球置于配备波长为1,064纳米、空气中焦点直径为10微米的Nd:YAG激光器的裂隙灯装置前方。选择12倍放大倍率，并偏转照明光路以观察角膜各层结构。

在将脉冲能量和焦点位置调整至适宜参数以选择性消融角膜内皮细胞后，对组织施加数次激光脉冲。随后在解剖显微镜下，于角膜缘附近做一个透明角膜穿刺口，注入粘弹性物质以稳定前房。然后使用直径为8毫米的角膜环钻切除经激光处理的中央角膜，并将分离出的角膜放入12孔板中的一个孔内，内皮面朝上放置。

当所有角膜收集完毕后，向每个样本孔中加入三毫米完全培养基，并在37摄氏度下孵育标本最长三天。孵育结束后，将每孔中的培养基替换为不含甲醇的4%多聚甲醛Sorensen缓冲液，在室温下孵育20分钟。孵育结束后，将固定后的样本置于含20%蔗糖的PBS溶液中约一小时，直至角膜下沉。

将样本转移至含30%蔗糖的PBS溶液中，4℃过夜孵育，随后将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并于-80℃保存。使用设定为-27℃的冷冻切片机对冷冻组织进行切片，获得厚度为10 µm的切片，并在切片完成后1分钟内将其收集至载玻片上。切片完成后，将载玻片于-80℃保存，直至染色。

进行苏木精-伊红染色时，先将冷冻切片在空气中干燥数分钟以去除水分，然后在50毫升离心管中用滤过的0.1% Mayer苏木精染色10分钟。染色孵育结束后，在比色皿中用双蒸水冲洗切片5分钟。接着将切片浸入0.5%伊红溶液中10次，随后在双蒸水中浸洗，直至伊红不再出现拖尾现象。

将清洗后的载玻片在50%乙醇中浸洗10次，再在70%乙醇中浸洗10次。最后一次70%乙醇浸洗后，将切片在95%乙醇中平衡30秒，随后在100%乙醇中处理60秒，再在二甲苯中多次浸洗。最后用盖玻片封片，并在光学显微镜下观察成像。

双光子和光学显微图像应独立评估，判断为无损伤、损伤过度或损伤程度适当。根据这些评估结果，可进一步生成热图，以选择合适的激光参数组合，实现对角膜内皮细胞的选择性消融，同时将对周围组织的损伤降至最低。先前的分析已确定，对于所测试的最低脉冲能量，激光焦点必须位于角膜内皮后方至少0.15毫米处。

当脉冲能量高于 2.9 毫焦时，所测试的最长焦距仍然过于接近内皮层。可在离体样本培养期间测试多种细胞保护剂。若证实有效，可将其添加至灌注液中用于治疗。