结合激光捕获显微切割与微流控qPCR分析单细胞转录谱：一种研究阿片类药物依赖的系统生物学方法

这是一种在单细胞水平上研究基因表达的高准确性且经济有效的方法。该技术的主要优势在于，我们可以在一个批次中同时处理96个样本。如此高的样本通量使我们能够识别具有解剖学特异性的细胞亚表型。

该方法的流程可应用于任何生物学问题、任何系统、任何组织，以探究单个神经元或其他细胞类型在疾病或任何其他干扰、任何功能状态下的个体细胞反应。然后进一步探究这些细胞反应是否具有解剖学上的结构特征。将脑组织从样本收集盒中取出，并放置到冷冻切片机的样品夹上。

通过将10微米厚的切片贴附于普通玻璃载玻片上，收集包含杏仁核中央核或其他选定脑区的切片。立即将载玻片置于放置在干冰上的金属盘上。尽快将带有脑切片的载玻片放入-80摄氏度的超低温冰箱中。

进行乙醇和二甲苯脱水系列操作时，首先将切片浸入75%乙醇中30秒。紧接着，将切片浸入95%乙醇中30秒，随后将切片浸入100%乙醇中30秒。

最后，将玻片直接浸入第二个装有100%乙醇的容器中，持续30秒。经过乙醇脱水系列步骤后，将玻片浸入新配制的二甲苯中1分钟。随后立即把玻片放入第二个二甲苯容器中浸泡4分钟，然后按照文本方案所述进行干燥。

利用荧光识别目标区域中染色的细胞类型及其细胞核。若制备单细胞混合样本，可选择一个或多个细胞。使用激光捕获显微切割（LCM）软件标记目标细胞。

将LCM帽放置在切片的目标区域上方，并按照文本方案所述，将LCM帽的粘合剂熔化覆盖至所选单个细胞的区域。使用LCM软件工具选择需收集用于分析的单个细胞。所选细胞必须位于基于大鼠脑图谱和前囟位置确定的杏仁核中央核解剖区域内。

细胞应距离相邻的染色细胞核至少三微米。然后发射红外激光以收集已识别的单个细胞。将盖片放入质控站并进行观察，确保仅选中了目标细胞。

如果误选了其他细胞，可以使用紫外激光在帽仍位于质控站时摧毁不需要的细胞。拍摄细胞采集部位的组织切片照片，以记录其解剖学特异性。如适用，可参考大鼠脑图谱，记录切片与前囟之间的距离。

从质控工作站上取下LCM帽，连接样本提取装置。然后将5.5 µL裂解缓冲液加入样本中。将提取装置安装在0.5 mL微量离心管上，置于75 °C的加热板上孵育15分钟。

将样品和裂解缓冲液在低速下离心30秒，并将收集的样品放入-80摄氏度冰箱中。为了对动态阵列芯片进行单细胞mRNA的预扩增，首先在新的96×96 PCR板的每个孔中加入5 µL 5X VILO。从-80摄氏度取出LCM单细胞样品，短暂解冻。

低速离心后，取5.5 µL裂解后的单细胞样品，加入PCR板中，每个样品加入单独的孔内。将含有样品和VILO的PCR板放入热循环仪，于65 °C加热1.5分钟。随后在4 °C、1,300 ×g条件下离心1分钟，并将PCR板置于冰上。

向每个孔中加入10X cDNA合成主混合液、T4 Gene 32蛋白和DNA悬浮缓冲液。将样品板一（PCR板）放入热循环仪中，并按照文本方案中所述条件运行。循环结束后，向96孔PCR板的每个孔中加入9微升Taq聚合酶溶液。

9微升反应体系包含7.5微升Taq聚合酶预混液和1.5微升引物混合液。现在将PCR板放入热循环仪中，并运行文本方案中详述的预扩增程序。完成预扩增程序后，向96孔PCR板的每个孔中加入6微升外切酶溶液。

外切酶溶液包含0.6 µL的10X外切酶一反应缓冲液、1.2 µL的外切酶一以及4.2 µL的DNA悬浮缓冲液。将PCR板放入热循环仪中，并运行文本方案中列出的程序。最后，向1号样本板的每个孔中加入54 µL的TE缓冲液。

将PCR板在1,300 × g条件下离心5分钟。若立即进行下一步操作，则在4°C下保存。在新的96孔PCR板（即样品板二）中，加入5 µL DNA结合染料与主混合溶液。

从1号样本板中取3微升预扩增样本，加入2号样本板的对应孔中。将PCR板在1,300 ×g条件下离心，随后置于冰上。在另一块新的96孔PCR板（即2号检测板）中，每孔加入5微升检测加样溶液。

检测加样溶液每孔包含3.75微升的2X GE检测加样试剂和1.25微升DNA悬浮缓冲液。然后将检测板一中2.5微升10微摩尔的qPCR引物加入到检测板二中对应的孔内。将PCR板在1,300 ×g条件下离心5分钟。

为了加载并运行动态阵列芯片，首先使用控制线流体对芯片进行预处理。然后将芯片放入 IFC 控制器 HX 中，并运行 prime 136X 脚本。从2号样品板中吸取六微升（6 µL）样品，加入96×96动态阵列芯片对应的样品孔中。

现在，从2号检测板中吸取六微升样品，加入96×96动态阵列芯片中对应的检测孔内。使用针头刺破96×96动态阵列芯片各孔中的气泡。随后将芯片放入IFC控制器HX中，并运行load mix 136X程序。

接下来，将芯片从 IFC 控制器 HX 中取出。将 96×96 动态阵列芯片放入微流控 RT-qPCR 平台，并运行 GE 快速 96×96 PCR 程序。单细胞的选择通过视觉和分子方法进行了验证。在细胞收集前，通过视觉观察细胞形态。

此处展示的是包含杏仁核中央核的半切大鼠前脑切片的代表性图像。后续图像显示了单个细胞的选择及其从组织中分离以进行转录组分析的过程。在分子水平上，细胞类型特异性标志物在其相应的细胞类型中表现出表达水平升高。

具体而言，在神经元中观察到 NeuN 表达增加，在小胶质细胞中观察到 Maf 表达增加，在星形胶质细胞中观察到 Gfap 表达增加。热图显示了所有样本在 40 个检测基因上的表达情况。行代表张力合并样本，数字表示样本聚类，列代表基因。

多变量分析方法显示，戒断组中的星形胶质细胞是受影响最显著的细胞类型。结合其他研究的背景，这些数据表明星形胶质细胞在阿片类药物戒断期间很可能在杏仁核中央核的炎症过程中发挥关键作用。使用该技术时最重要的是注意正确的移液操作，以尽量减少气泡的产生。

这些实验的转录组学发现可通过免疫荧光或蛋白质印迹等蛋白质检测方法在相同组织上进行验证。