实体瘤的预测性免疫建模

全面表征肿瘤微环境在肿瘤免疫学研究中至关重要。该检测是首个利用基于RNA的健康表达模型来测量实体瘤组织中免疫细胞的方法。该检测使研究人员能够对FFB实体瘤组织中的免疫微环境进行高灵敏度和高特异性的定量分析，并可将这些结果整合为一个多维度的生物标志物。

所有癌症治疗方法，而不仅仅是免疫疗法，都会在实体瘤部位引发免疫反应。测量这种免疫反应对于理解疾病进展和治疗反应至关重要。本方案将传统的RNA文库制备技术与靶向捕获相结合。

尽管耗时，遵循建议的洗涤步骤并监控质量控制关键点对成功至关重要。对于来自福尔马林固定石蜡包埋样本的高度降解RNA，应根据表格在冰上配制第一链合成反应体系。在微量离心机中短暂离心样品前，通过反复吹打数次充分混匀反应液。

离心结束后，立即将样品放入预热的热循环仪中，按照表格中的程序三进行操作。对于高质量的完整RNA，按照表格中所述，在无核酸酶的PCR管中于冰上配制第一条链合成反应体系。开始此操作时，将200纳克目标条形码文库与2微克COT-1 DNA以及2微升阻断寡核苷酸在无核酸酶的PCR管中混合。

然后使用真空浓缩仪，在30至45摄氏度条件下干燥管内样品。杂交完成后，从PCR仪中取出样本，并将PCR仪温度设置为65摄氏度，加热盖温度设为70摄氏度进行孵育。使用多通道移液器将17微升充分混匀的磁珠转移至样本中，并上下彻底吹打10次。

为使DNA结合到磁珠上，将试管放入热循环仪中，按照程序10运行，每隔10至12分钟短暂取出一次试管条，轻轻涡旋振荡3秒，以保持磁珠充分悬浮。结合孵育结束后，立即从热循环仪中取出一条试管，向各管中加入100微升预热的洗涤缓冲液一。用移液器上下充分吹打10次，然后将试管置于磁力架上，使磁珠完全与洗涤液分离，随后吸除含有未结合DNA的上清液。

从支架上取下离心管，加入150微升预热的严格洗涤缓冲液，充分混匀，彻底重悬磁珠，注意避免产生气泡。将离心管放回65摄氏度的热循环仪中孵育5分钟，然后将离心管再次置于磁力架上，使磁珠完全与上清液分离。弃去含有未结合DNA的上清液，按照上述方法用预热的严格洗涤缓冲液再洗涤磁珠一次，共进行两次严格洗涤。

最后一次洗涤后，移除上清液，并向各管中加入150微升室温洗涤缓冲液一。用移液器吹打10至20次，充分重悬磁珠，将样品在密封盖下孵育2分钟，期间交替进行30秒涡旋振荡和30秒静置。孵育结束后，短暂离心，将管子置于磁力架上，待磁珠完全吸附至磁铁一侧后，移除上清液。

将管子盖上管盖后短暂离心，并将样本放回磁力架上。使用10微升移液器去除残留的洗涤缓冲液，然后加入150微升室温洗涤缓冲液二。用移液器吹打10至20次，充分重悬磁珠，随后密封管盖，将样本孵育两分钟，期间交替进行30秒涡旋振荡和30秒静置。

短暂离心后，将每根试管中的全部珠子转移至洁净的无核酸酶 PCR 管中，并将试管置于磁力架上。弃去含有未结合 DNA 的上清液后，再次短暂离心样品，并使用 10 微升移液器在珠子处于磁力架上的同时吸除残留的洗涤缓冲液。向各管中加入 150 微升洗涤缓冲液三，上下吹打 10 至 20 次，彻底重悬珠子。

将离心管孵育2分钟，交替进行30秒轻柔涡旋和30秒静置，然后短暂离心。将离心管置于磁力架上，吸除上清液，并再次短暂离心磁珠样品。当磁珠仍处于磁力架上时，使用10微升移液器吸去磁珠表面残留的洗涤缓冲液，随后将离心管从磁力架上取下，每管用20微升无核酸酶水重悬磁珠。

然后用移液器吹打珠子10次，以确保粘附在管壁上的珠子完全重悬。应评估接头二聚体的存在情况，以确定是否需要进一步纯化。例如，此电泳图显示接头二聚体水平可接受，表现为约128个碱基对处的尖锐峰，而此电泳图显示接头二聚体水平不可接受。

治疗前后的免疫谱可用于理解特定疗法对肿瘤微环境的影响，如此处所示的代表性分析，其中展示了一名患者在化疗前后每种目标免疫细胞百分比的变化以及总免疫细胞含量的变化。在本分析中，根据治疗后疾病进展时间，比较了不同患者组间的样本。一部分患者在18个月后出现疾病复发，而另一部分患者则在18个月或更短时间内进展更快。

随后可比较每个样本的中位数delta值，以鉴定疾病进展的潜在生物标志物。例如，在此鉴定出两个免疫逃逸基因作为样本分组的具有统计学显著性差异的区分指标。由于单个基因生物标志物具有稳健性且统计学显著性明确，多维生物标志物并未增加显著的预测价值。

务必一次对一个条带进行加热洗涤，以防止样品冷却，并记得将磁珠转移至新的离心管中，以避免非靶向污染。本方案展示了利用基因表达模型来定量免疫细胞和肿瘤组织的方法。目前正开发新的模型，用于检测细胞状态，例如耗竭或活化。