多重免疫荧光分析与肿瘤内 PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ T 细胞的定量

多重免疫荧光分析的总体目标是根据细胞表型自动计数细胞。该方法通过多荧光标记和自动细胞计数，分析肿瘤微环境中肿瘤免疫细胞的表型与功能。该技术有助于基于直接来源于肿瘤微环境的标志物，生成两种类型的复合预后预测。

通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为表型分析过程非常漫长，且获得的原始数据需要进一步处理。我们最初提出该方法的想法，是在尝试对安诺德·米兰提细胞的表型及其免疫学相互作用进行表征时。解冻后，使用纸巾小心擦干组织切片周围的载玻片，然后用疏水屏障笔在组织周围画圈。

待屏障干燥后，将样本置于100%丙酮中固定5分钟，随后室温晾干2分钟，再用TBS缓冲液洗涤载玻片10分钟。将载玻片在避光条件下用3滴0.1%亲和素（Avidin）溶液预处理10分钟，然后轻敲或轻弹载玻片，使亲和素溶液覆盖组织。每个样本加入3滴0.1%生物素（biotin），同样轻敲或轻弹使生物素溶液均匀覆盖样本，随后按上述方法进行TBS缓冲液洗涤。

然后在室温下用 100 µL 含 5% 正常血清的 TBS 封闭非特异性结合位点，孵育 30 分钟。孵育结束后，轻拍玻片以去除多余的血清，并在湿盒中加入 100 µL 目标一抗混合液，孵育 1 小时。将标记抗体的玻片在 TBST 中洗涤 5 分钟。

干燥后，在湿盒中加入100 µL目标二抗混合液，标记30分钟，随后用TBS缓冲液洗涤10分钟。将干燥后的载玻片上的二抗标记样本加入100 µL目标三抗混合液，孵育30分钟，再用TBS缓冲液洗涤10分钟。洗涤结束后，干燥载玻片，并使用含DAPI的封片剂封片。

然后用盖玻片封固每张载玻片，并让封片剂至少固化两小时。扫描载玻片时，打开显微镜软件并加载图像扫描程序，将第一张载玻片放置到显微镜载物台上。

然后在控制栏中，单击设置曝光时间，并调整每个滤光片的曝光时间，直到获得足够但未达到饱和的信号。单击上方面板中的“开始”，并打开 LabID 文件夹。输入第一张载玻片的编号，然后单击“下一步”。

在4倍放大倍数下获取明场光下的载玻片整体图像，请点击单色成像并找到样本。若要选择需要扫描的组织区域，请按住控制键并使用光标选择或取消选择需在4倍放大倍数下扫描的兴趣区域。为获得每个区域的红色/蓝色/绿色荧光图像，请点击低倍成像。

选择高倍视野时，按住控制键并至少选择五个与将在20倍放大下扫描的组织区域相对应的兴趣区域。然后，为获取每个视野的多光谱图像，单击高倍成像，再单击数据存储，将图像保存至相应的实验室ID文件夹中。在文件菜单下创建新项目时，选择新建项目；在查找功能菜单下，选择细胞分割；在表型分析菜单下，选择表型分析，然后单击配置。

在图像格式中，选择多光谱。在样本格式中，选择荧光。为了将代表性图像整合到项目中，在文件菜单下点击打开图像，并选择该系列中 10-30 张代表性图像。

为消除自发荧光，打开未染色切片，选择光谱库来源及相应的荧光染料。点击自发荧光选项，并在空白切片上选择自发荧光区域。为生成复合图像，选择“全部准备”以整合荧光光谱库与自发荧光光谱。

单击眼睛图标以打开视图编辑面板，并取消选择自发荧光，以去除自发荧光信号。为每个标记选择合适的颜色。要进行细胞分割，请在区室菜单中选择细胞核和细胞膜。

在“nuclei”菜单下，将 DAPI 设置为细胞核复染剂。点击“segment cells”，并检查细胞膜中细胞核的分割情况。为了对细胞进行表型分析，在“phenotype”菜单下，点击“add”。

为创建细胞表型类别，需选择五种以上具有代表性的荧光染料及荧光染料组合，然后点击“训练分类器”。分类器将生成一种算法，为每个细胞分配相应的表型，并提供置信区间。放大图像以检查细胞的表型。

然后单击“表型全部”以保存表型算法和图像项目，在文件菜单下选择“保存项目”。接着为项目命名并保存。要对系列进行批量分析，请选择批量分析并选择已保存的项目。

选择一个文件夹用于存储批量数据。添加待分析的图像，然后点击运行。分析结束后，检查合成图像的质量，并验证该系列中所有图像的表型鉴定结果。

通过荧光多光谱成像技术对透明细胞肾细胞癌标本中的肿瘤浸润性CD8阳性T细胞进行分析，结果显示约一半的CD8阳性T细胞仅表达PD-1（单阳性），约1/3同时表达PD-1和Tim-3（双阳性）。在将这些不同细胞信号整合至组织切片后，进一步测量PD-1阳性且Tim-3阳性与PD-1阳性但Tim-3阴性的CD8阳性T细胞中PD-1的荧光强度，发现当Tim-3共表达时，PD-1的平均荧光强度（MFI）更高，这强化了Tim-3表达的功能相关性。在此代表性实验中，66%的肾癌患者也呈PD-1配体表达阳性，而100%的患者呈Tim-3配体Galectin-9阳性。

对肾细胞癌患者肿瘤组织的临床评分也表明，表达PD-1和Tim-3的肿瘤浸润性CD8阳性T细胞的数量和百分比与预后评分参数呈正相关，而表达PD-1但不表达Tim-3的CD8阳性T细胞则无此相关性。有趣的是，CD8阳性T细胞中同时表达PD-1和Tim-3的百分比高于中位数的肾细胞癌患者更易发生复发，而仅表达PD-1但无Tim-3共表达的情况则与患者复发无关。在进行该实验操作时，重要的是应由两名独立的研究人员（如有条件，应包括一名病理学家）共同对细胞表型进行复核。

在完成该操作后，可进一步开展其他实验，如流式细胞术，以探究体外刺激后自身表型对细胞功能影响的更多问题。该技术建立后，为癌症领域研究人员探索病变器官中的免疫应答开辟了道路。