利用鸡绒毛尿囊膜体内模型研究妇科和泌尿系统癌症

将肿瘤移植到鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）上，可用于研究肿瘤发生能力、治疗效果或细胞间相互作用。该方法可在免疫耐受的活体环境中实现快速且成本较低的肿瘤生长。利用CAM模型，可使用细胞系甚至患者肿瘤样本快速测试新的治疗策略。

本方案最关键的步骤是确保鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）正常形成，并在打开鸡蛋时避免破坏CAM或其血管系统。在发育第7天或第8天，当CAM已完全发育时，关闭蛋旋转器，并将约1至3枚鸡蛋放入生物安全柜内的蛋架中。关闭灯光后，将照蛋仪紧贴蛋壳，以识别并标记其中一枚鸡蛋的气室位置，然后移动照蛋仪观察蛋壳，寻找具有丰富血管网络的区域，必要时旋转鸡蛋以调整角度。

理想的血管系统应位于蛋的中部附近并在此处分支。使用记号笔描出将用于植入的血管系统。在重新打开超净台的光源后，使用装有碳化硅磨头的无线旋转工具，在气室正上方的蛋壳处钻一个小孔。

当大部分蛋壳已被去除，但白色内膜仍保持完整时，在即将打开血管窗的位置再钻一个小孔，操作方法如前所述。当第二个孔准备就绪后，使用18号针头轻轻刺破气室和血管区域上方的白色内膜，注意在整个钻孔区域内仅破坏白色内膜，而不要损伤绒毛尿囊膜（CAM）。再次关闭通风橱灯光，使用检卵灯确认气室已从蛋的末端转移至血管区域上方。

如有必要，将连接至移液控制器的真空管插入气室上方的孔中，并短时轻柔施加吸力，以移动气室。在 CAM 气室边界的内侧约 0.5 厘米处标记气室新位置的轮廓，并用一块刚好能覆盖新气室上方孔洞的封箱胶带将其封住。按照上述方法准备好另外两个鸡蛋后，将鸡蛋放回培养箱，并按上述方式每次打开一至三个额外的鸡蛋进行实验。

当所有鸡蛋均打开后，将一至三个气室已移位的鸡蛋转移至生物安全柜中的蛋架上，使用装有圆形切割轮的无线旋转工具，在气室边界上方完全切开一条小切口，穿透气室但不破坏绒毛尿囊膜（CAM）或血管系统。用弯头剪刀沿剩余的气室边缘剪开，形成蛋壳窗口，并检查胚胎的存活状态。存活的胚胎会表现出丰富的血管网络、透明的蛋白、胚胎活动和/或可见的心跳。

在无活性的胚胎中，尿囊绒毛膜可能呈现不透明状，血管稀少甚至完全缺失，胚胎可能体积微小或缺如，且无运动或心跳。使用Semkin镊子从无菌棉球上取下小块棉絮，轻轻擦拭有活性胚胎的尿囊绒毛膜表面，以去除壳灰和碎屑，然后用一块大小为六厘米乘七厘米透明敷料的四分之一覆盖蛋壳开口，注意不要触碰尿囊绒毛膜，并将蛋放回孵育箱，使开口朝上。对于容易滚动的蛋，可使用蛋架的一部分、蛋旋转器的边缘或其他合适物品将其固定。

为制备用于移植的癌细胞悬液，从目标癌细胞培养物中收集细胞，并通过离心沉淀细胞。吸除上清液后，用残留的培养基通过机械方式重悬细胞。将细胞悬液置于冰上，并使用移液器测量细胞在培养基中的体积。

然后将细胞重悬于20至100微升培养基中，细胞浓度为每毫升100万至200万个细胞，培养基中需添加2.7至4毫克/毫升的细胞外基质以及任何感兴趣的生长因子或其他添加剂。对于癌细胞移植，使用无粘性环将最多六个待移植的鸡蛋放置于蛋架上，并将透明薄膜敷料的边缘向开口处卷起，以去除蛋壳表面的薄膜。检查鸡蛋是否具有活性且健康状态良好。

理想的卵应具有一个主血管，并在打开区域的中央伴有较小的分支血管。使用弯头虹膜镊，将无菌防粘环放置在主血管上方的绒毛尿囊膜（CAM）上，最好覆盖在分支点处。用无菌玻璃搅拌棒轻轻擦伤绒毛尿囊膜，并将癌细胞悬液滴加至环的中央。

当所有细胞接种完毕后，用一块大小为六乘七厘米透明敷料的四分之一封住开口，并在蛋壳上贴上适当的移植标记。然后将鸡蛋稳妥地放入培养箱中，使蛋壳的开口朝上。若不使用防粘连环接种癌细胞，可将细胞悬液吸入适当大小的移液器吸头中，小心握住吸头顶部，将吸头内的液体缓缓排出，并将吸头水平放置于无菌的10厘米组织培养皿中。

尖端加样完成后，将培养皿放入37摄氏度的培养箱中孵育15至30分钟，并在15分钟后检查是否发生聚合。每个尖端放入培养皿时通常会有少量液体渗出。利用该液体来估计尖端内聚合的程度。

当基质准备就绪后，将一个吸头装到适当规格的移液器上，按压移液器推杆，将部分聚合的细胞悬液推至鸡胚尿囊膜（CAM）上，理想位置应位于发育良好、分支明显的较大血管的分叉处。采用这些方法，人和小鼠的卵巢癌细胞系以及原发性肿瘤组织均成功移植并形成肿瘤，其形态学特征与其他体内模型中观察到的结果一致。在所测试的肿瘤类型中，卵巢癌的生长程度明显较弱，通常需要借助生物发光成像才能观察到。

还可以利用这些方法测试在植入时添加生长因子或激素的影响。对于肾癌，植入已建立的细胞系来源的透明细胞肾细胞癌细胞或原发性人肾肿瘤组织块，均可快速且稳定地形成肿瘤。此外，已使用多种人源和鼠源前列腺癌细胞系、人源膀胱癌细胞系以及原发性肿瘤组织块，通过该模型成功建立肿瘤。

在打开窗口时，必须避免破坏尿囊绒毛膜（CAM）及其血管系统，并确保CAM不与蛋壳粘连。成功移植后，CAM模型可用于评估感兴趣治疗方法的疗效，或研究肿瘤内不同细胞类型之间的相互作用。