利用快速定量的鸡胚尿囊膜活体模型发现转移调控因子

本方案可高效鉴定在斑马鱼体内抑制癌症侵袭的单个基因或基因组合。该体外培养方法无需依赖高级动物饲养设施进行维护。总体而言，利用斑马鱼模型可在数周内对通用基因文库或特定基因文库进行筛选。

这种高通量筛选系统将有助于研究人员发现新的治疗性基因靶点或基因靶点组合，可用于阻断癌症转移。进行尾静脉注射时，使用预冷的1×PBS将细胞浓缩并重悬至每毫升0.5至100万个细胞。预计每10个胚胎需要约1毫升的细胞悬液。

组装注射装置时，先将针头安装到注射器上，然后用一段3至5厘米长的管路延长注射器针头。使用精细镊子折断硼硅酸盐针头的尖端。向注射器中加入50至200微升的癌细胞悬液。

将硼硅酸盐针头插入管路中。检查针头是否有细胞堵塞和气泡。若观察到毛细管内有细胞堵塞，需取下毛细管，重新悬浮细胞，并更换新的毛细管。

使用柱塞推出所有气泡。取下盖子，将胚胎转移至体视显微镜下。在CAM表面确定合适的静脉注射位置，该静脉通常仅略宽于硼硅酸盐针尖的直径，并位于胚胎与称重皿壁之间的中点处。

通常在静脉分叉处紧邻的位置注射更为容易。将针尖抵住血管壁，并沿血流方向施加轻柔的压力。如有必要，可使用棉签帮助固定或稳定待注射的血管。

轻轻按压注射器活塞，持续2至10秒，直至注入所需体积。若注射部位出现明显出血或清亮液体积聚，则弃去该胚胎。将针头从尿囊膜（CAM）中取出，并用棉签轻轻擦拭注射部位，以清除血液或多余的癌细胞。

将注射后的胚胎用称量皿盖子盖好，并放回培养箱中。重复此操作，直至所有胚胎完成注射。目视检查胚胎是否存在细菌或霉菌污染，以及是否死亡。

根据实验室废弃物处理程序丢弃受污染的胚胎。确保在注射后第一至第三天内转移性克隆在形态上保持均一，并在注射后第四至第五天鉴定侵袭性或非侵袭性转移性克隆。

注射后第5天，从培养箱中取出胚胎，观察并确定胚胎绒毛尿囊膜（CAM）上转移灶的分布情况。在解剖显微镜下，用精细镊子轻轻向上提起含有目标转移灶的CAM组织，用手术剪将其剪下。将CAM组织转移至一个洁净无菌的1.5毫升离心管中，并盖紧管盖。

重复切割操作，直至将所有目标菌落分别收集到不同的离心管中。使用单独的无菌18号针头，在微量离心管中轻轻切碎CAM组织。加入100 µL的1×胶原酶A溶液，在37 °C下孵育30分钟。

在室温下以300 × g离心5分钟，沉淀细胞和CAM组织。吸除胶原蛋白A溶液，将细胞重悬于目标细胞系的完全培养基中。然后再次离心细胞和组织。

将细胞和组织块重新悬浮于一毫升完全培养基中，如有需要，加入筛选因子。然后转移至一个12孔组织培养板的单个孔中。在接下来的一至三周内，每天监测癌细胞的生长情况和污染情况。

当细胞融合度达到70%至80%时，将其转移至更大体积的培养皿中。一旦获得足够的癌细胞数量，立即进行测序或下一轮筛选。由于注射失败导致癌细胞积聚的胚胎，可在大多数毛细血管中观察到。

当达到最佳细胞浓度和注射持续时间时，注射后第五天的转导细胞应产生多种多样的集落表型，其中大多数集落具有侵袭性，表现为癌细胞在绒毛尿囊膜（CAM）组织中呈弥散分布。应特别关注那些形态致密且与邻近集落相距较远的转移性集落，以便能够用镊子和剪刀连同一块CAM组织将其完整切除。一个独立的阳性筛选结果在再次注射后应仍表现出致密集落表型。

在测量癌细胞与血管接触时，应注意血管壁染色的亮度，并注射适量的凝集素以获得清晰的血管壁信号。进行本方案时，应避免注射量过少或过多，并清除多余的出血或液体积聚。利用该技术，已鉴定出多个在观察者中驱动癌细胞侵袭的新型基因。