量化细胞毒性 金黄色葡萄球菌 抗人多形核白细胞

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，可产生多种毒力因子，促进其致病过程。这些因子包括双组分白细胞毒素，可破坏多形核白细胞（也称为PMN或中性粒细胞）的膜完整性。本视频展示了从中性粒细胞全血中分离PMN的方法，以及两种用于定量金黄色葡萄球菌对这些重要先天免疫细胞毒性的独立检测方法。

这些检测均可使用常规实验室设备完成，并可轻松调整以研究宿主与病原体相互作用的其他方面。本实验将使用从人类供体采集的全血，需获得相应机构委员会或审查委员会的批准，以及声明已从所有参与者获得知情同意。该实验方案的第一步是通过离心和密度梯度法分离中性粒细胞。

首先，将 50 毫升 3% 右旋糖酐-0.9% 氯化钠溶液、35 毫升 0.9% 氯化钠溶液、20 毫升 1.8% 氯化钠溶液、12 毫升 1.077 克/毫升的菲可溶液以及 20 毫升水置于室温。将 25 毫升新鲜采集的肝素抗凝全血转移至两个锥形离心管中。将 25 毫升新鲜采集的肝素抗凝全血与等体积（25 毫升）室温的 3% 右旋糖酐-0.9% 氯化钠溶液按 1:1 比例混合。

轻轻摇动每个50毫升锥形管以混匀，然后在室温下静置30分钟。室温孵育后，将出现两层分离的液体。将每份葡聚糖血液混合物的上层转移至新的50毫升锥形管中。

在室温下以450 g离心10分钟，离心时设置低减速或不减速。小心吸除上清液并弃去，注意不要扰动细胞沉淀。将每份细胞沉淀轻轻重悬于2毫升0.9%氯化钠溶液中。

将重悬的沉淀合并至一个50毫升的锥形管中，然后加入剩余的0.9%氯化钠溶液，定容至终体积35毫升。使用手动移液器，将10毫升密度为1.077克/毫升的Ficoll溶液小心地铺在细胞悬液下方。在室温下以450 ×g离心30分钟（低速或无刹车），随后轻轻吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，操作方法如前所示。

通过将细胞沉淀重悬于20毫升室温水中来裂解红细胞。轻轻摇动30秒进行混匀。立即加入20毫升1.8%氯化钠溶液，并在室温下以450 ×g离心10分钟。

小心吸取上清液，操作如前所示。用 2 毫升室温 RPMI 轻柔重悬细胞沉淀，并置于冰上。使用血细胞计数板对细胞进行计数。

将纯化的中性粒细胞用预冷的RPMI重悬，浓度为每毫升1×10⁷个细胞，并置于冰上保存。取100 µL纯化的中性粒细胞与300 µL含1 µL碘化丙啶染料的DPBS混合，分装至两支流式细胞术检测管中，每管设两个重复。作为阳性对照，向其中一支流式细胞术检测管中加入40 µL 0.5% Triton X-100溶液，并充分混匀。

采用流式细胞术检测前向散射光、侧向散射光及碘化丙啶染色情况，以评估分离所得中性粒细胞的纯度和完整性。仅可使用纯度高于98%且碘化丙啶阴性率高于95%的中性粒细胞样本。有关正常人血清分离的详细方案，请参阅完整论文。

通过向将用于本实验的各个孔中加入100微升用DPBS稀释的20%分离人血清，准备用于中性粒细胞（PMN）细胞毒性检测的96孔板。务必至少设置一个仅加入培养基的阴性对照孔，以及一个加入0.05%Triton X的阳性对照孔。将板在37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，用100微升预冷的DPBS洗涤标记孔两次，并将板置于冰上。

从孔板各孔中移除残留的DPBS，轻柔地向每个编码孔中加入100微升纯化的人中性粒细胞（PMNs），细胞浓度为每毫升1×10⁷个细胞。将接种后的中性粒细胞置于冰上至少5分钟，使其充分沉降，随后用于以下细胞毒性检测。本部分描述了一种定量检测金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的胞外蛋白对人中性粒细胞细胞毒性的实验方法。

实验前一天，在37°C摇床培养箱中，使用适当的培养基过夜培养金黄色葡萄球菌（S.aureus）。将过夜培养的菌液用新鲜培养基按1:100比例稀释，进行转接培养。在37°C条件下振荡培养，直至细菌达到早期稳定生长期。

培养5小时后，取1毫升S.aureus子培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以5,000 g离心5分钟。离心后，吸除上清液。将吸除的上清液通过0.22微米注射器滤器过滤至新的1.5毫升微量离心管中，并置于冰上。

用冰上预冷的培养金黄色葡萄球菌的培养基对上清液进行系列稀释。按照前述方法，将上清液样本或用于阴性和阳性对照的培养基轻柔地加入含有中性粒细胞（PMNs）的96孔板的各个孔中，并将板置于冰上。轻柔振荡平板，使上清液在各孔中均匀分布，随后在37°C下孵育。

在预定时间将培养板从培养箱中取出，置于冰上。向每根流式细胞术检测管中加入含有1微升碘化丙啶的300微升预冷DPBS溶液。将样品转移至盛有冰的流式细胞术检测管中。

对于阳性对照孔，在转移至流式细胞术检测管之前，向样品中加入 20 微升 10% Triton X。使用流式细胞术分析中毒性中性粒细胞的碘化丙啶染色情况。本部分描述了一种定量测定人中性粒细胞吞噬后金黄色葡萄球菌（S.aureus）细胞毒性的实验方法。

在本实验中使用相关金黄色葡萄球菌菌株之前，必须测定其在600纳米处的光密度和细菌浓度所定义的生长曲线。按照前述方法启动金黄色葡萄球菌菌株的过夜培养，并进行细菌传代培养。当传代培养的金黄色葡萄球菌达到对数生长中期时，将一毫升培养物转移至1.5毫升微量离心管中，并在室温下以5,000 g离心五分钟。

用移液管吸去金黄色葡萄球菌的上清液，注意不要扰动菌体沉淀，然后将沉淀的细菌重悬于1毫升DPBS中。将样品涡旋振荡30秒。在室温下以5,000 g离心5分钟。

为了对金黄色葡萄球菌进行氧化处理，首先将细菌沉淀物重悬于1毫升20%人血清中。然后在37°C条件下振荡孵育15分钟。随后通过离心洗涤氧化处理后的金黄色葡萄球菌，步骤如前所述。

用预冷的RPMI培养基将氧化应激处理的金黄色葡萄球菌菌株稀释至每毫升1 × 10⁸个菌落形成单位（CFUs）。涡旋振荡样品30秒后置于冰上。通过将细菌进行10倍系列稀释后涂布于琼脂平板，确认本实验所用金黄色葡萄球菌的浓度。

从步骤1.14中，将每种金黄色葡萄球菌菌株或用于阳性和阴性对照的RPMI培养基，以每孔100 µL的体积轻轻加入置于冰上的96孔板中的PMNs细胞中。轻轻摇动培养板，使金黄色葡萄球菌在各孔中均匀分布。通过在4°C条件下以500 ×g离心8分钟同步吞噬作用，并在离心结束后立即将培养板转移至37°C孵育，此时间点记为时间零点。

在预定的时间点，将培养板置于冰上，向每根流式细胞管中加入含有1 µL碘化丙啶的200 µL冰冻DPBS，然后将样品转移至对应的管中。按照2.8和2.9步骤所述，通过流式细胞术分析样品的碘化丙啶染色情况。金黄色葡萄球菌（Staph aureus）产生的双组分白细胞毒素在靶向人中性粒细胞（PMNs）时，需要SA或S2组分系统，以展示本研究所述检测方法在量化金黄色葡萄球菌对人PMNs细胞毒性的应用价值。

这些实验采用一种临床相关的金黄色葡萄球菌（Staph aureus）分离株进行，该菌株被鉴定为USA300，并在该菌株中构建了SA或S的同源缺失突变体。左图显示的是纯化的中性粒细胞（PMNs），右图则作为示例展示了人为污染的样本。使用本方案第一部分所述方法分离的PMNs，经碘化丙啶染色后，通过流式细胞术进行检测。

多年来，前向散射和侧向散射图用于检测第1A和1B年纯化中性粒细胞（PMNs）时是否存在单核细胞或淋巴细胞污染。通过碘化丙啶染色法评估PMN的完整性。采用所述的人中性粒细胞纯化方法，我们能够稳定地分离出 5 × 10⁷ 至 1 × 10⁸ 个中性粒细胞，纯度超过98%，且碘化丙啶阴性率超过95%。

检测了USA300及其AsaeR/S突变株产生的胞外蛋白对纯化中性粒细胞（PMNs）的细胞毒性。这些实验表明，在与USA300产生的胞外蛋白共同孵育30分钟后，纯化的PMNs中碘化丙啶染色呈浓度依赖性增加，而与AsaeR/S突变株的胞外蛋白孵育则未观察到此现象。进一步实验显示，经USA300胞外蛋白处理后，碘化丙啶阳性的PMNs比例持续上升，并在约30分钟后达到平台期。

在暴露于AsaeR/S突变株产生的胞外蛋白后，所有时间点均观察到人PMNs的碘化丙啶染色极少。最后，检测了USA300及AsaeR/S突变株在同步吞噬后对PMNs的细胞毒性，发现在吞噬USA300后90分钟，碘化丙啶阳性的PMNs比例呈浓度依赖性增加。而在吞噬AsaeR/S突变株后，碘化丙啶阳性的PMNs数量显著减少。

在每项实验中，均对USA300和AsaeR/S突变株的接种物进行了计数，结果表明，这些菌株之间的细胞毒性差异并非由所用细菌浓度的不同所致。本方案描述了从人血中纯化中性粒细胞（PMNs）的两种方法，并介绍了定量检测金黄色葡萄球菌（S. aureus）对这些天然免疫细胞细胞毒性的两种技术。这些实验操作的成功取决于所纯化PMNs的质量，以及金黄色葡萄球菌或其上清液的适当制备。

进行这些实验操作时，请参考完整论文中需要考虑的重要事项。USA300 是一种具有强毒力的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）分离株，而 AsaeR/S 的缺失会显著降低针对人多形核中性粒细胞（PMNs）的毒力因子转录水平，因此这些菌株是使用所述检测方法比较细胞毒性的理想模型。当使用其他金黄色葡萄球菌（Staph aureus）菌株时，可能需要调整培养条件、上清液添加体积或细菌与PMNs的比例。