一种利用条件性 Cas9 稳定化评估基因功能的新工具包
2021年9月2日
本文介绍了一种基于小分子 Shield-1 条件性调控簇状规律间隔短回文重复序列相关蛋白9（Cas9）时空稳定性的基因组编辑工具。该方法可用于培养细胞和动物模型。
该方法可在小分子 Shield-1 存在下实现快速、温度可控的 CRISPR-Cas9 基因编辑。与 Cas9 的组成型激活相比，该方法还具有更少的脱靶效应、更低的细胞毒性，以及更高的内部可控基因编辑效率。该技术的主要优势在于可用于必需基因以及肿瘤存活基因的功能表征。
DD-Cas9 的去稳定化与其表达水平无关，因此可以在同一启动子下共表达目的基因。该方法可轻松应用于体内和体外研究。Shield-1 还能够穿透血脑屏障，因而也易于研究参与脑发育的基因。
使用含10%过滤胎牛血清的葡萄糖DMEM培养基，以每10厘米组织培养皿100万至200万个细胞的密度均匀接种健康的HEK293T细胞。将细胞置于组织培养孵育箱中，在5%二氧化碳和37°C条件下孵育20小时。次日，通过明场显微镜确认细胞密度达到70%融合度，并观察其在培养皿中分布均匀。
转染前一小时更换培养基，终体积为10毫升。准备两支试管，每管加入500微升预热的培养基。向第一管中加入25微升转染试剂，室温孵育5分钟。
向另一管中加入质粒混合物。将第一管与第二管混合，形成转染混合液，在室温下孵育20分钟。将转染混合液逐滴加入HEK293T细胞中，并将培养板置于组织培养孵育箱中孵育。
18小时后，小心更换培养基，加入10毫升含10% FBS的新鲜DMEM，以去除转染试剂。将细胞继续培养48小时。48小时后，用10毫升注射器收集上清液，并通过0.45微米滤膜过滤。
将病毒上清液分装后于-80摄氏度保存。为测定病毒滴度，每孔接种500万个HEK293T细胞至两块六孔板中。将两块六孔板于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜，使细胞融合度达到50%至60%。
第二天，使用六孔板之一计数六个孔中的细胞。解冻将用于进行系列稀释的病毒分装液，加入终浓度为每毫升8微克的polybrene试剂，准备含10%胎牛血清的DMEM培养基用于病毒的系列稀释，并加入polybrene试剂。用含有polybrene的培养基配制2毫升的慢病毒十倍系列稀释液，稀释比例从0.1至0.0001。
从六孔板中移除培养基，向各孔中加入一毫升病毒稀释液，留一孔仅加培养基作为阴性对照，另留一孔加入100%病毒。将细胞培养24小时。次日，从六孔板中移除含病毒的培养基，更换为两毫升含10%FBS的新鲜DMEM。
将细胞孵育48至72小时，每天使用荧光显微镜观察GFP。孵育48至72小时后，消化细胞并将其重悬于max缓冲液中。使用流式细胞仪测定GFP表达的百分比，并根据文稿中提供的公式计算病毒滴度。
将目标细胞系接种于10厘米培养皿中，过夜培养至细胞融合度达到50%至60%。随后用500至2,000微升病毒颗粒感染细胞，总体积为10毫升培养基。病毒感染培养24小时。次日，将病毒培养基更换为普通培养基，并通过流式细胞术检测GFP阳性细胞的比例。
使用 BD FACSAria II 进行细胞分选，筛选出 GFP 阳性细胞。扩增筛选后的阳性细胞并冻存备用。在感染后 24 小时，将筛选后的阳性细胞和未转导的细胞分别接种至 12 孔板中。
等待细胞贴壁后，更换为含有200纳摩尔Shield-1的细胞培养基。将转导和未转导细胞的培养板中的培养基更换，每块板保留两个孔使用常规培养基作为阴性对照。在向各孔加入Shield-1后，于0、2、6、12、24、48和72小时分别收集各孔细胞并提取蛋白质。
然后从其余孔中移除含有 Shield-1 的培养基，并更换为常规细胞培养基。在更换培养基后 2、6 和 12 小时收集这些孔中的蛋白质。通过检测转导细胞与对照细胞中 Cas9 蛋白的表达水平，确认其诱导表达情况，结果显示无论是否存在 Shield-1，Cas9 蛋白的表达水平均相似。
在用Shield-1处理转导的A549细胞系两小时后，Cas9表达出现充分诱导，撤除Shield-1后6至12小时内该表达可忽略不计。转导的A549细胞经Shield-1处理48小时后数量减少，但对Rinella样本无影响，该结果通过使用针对耗竭的RPA3蛋白的抗体进行免疫印迹验证。基因编辑倒位或插入缺失突变通过Surveyor核酸酶检测确认。
设计的慢病毒载体构建体为双顺反子系统，在同一EF-1a启动子下携带另一个目的基因。添加了一种改良的荧光蛋白P2A，用于追踪感染的细胞。在载体对照组和转导的A549细胞中均观察到mVenus蛋白的表达，该表达与DD-Cas9的表达及Shield-1处理无关。
细胞系高效转导 DD-Cas9 载体是限速步骤之一，因此保持 HEK293T 细胞的健康状态并使用低代次细胞至关重要。DD-Cas9 质粒、包装质粒和包膜质粒之间的比例优化对于实现最佳转染效果非常重要。此外，还需特别注意稳定 DD-Cas9 靶细胞所需的 Shield-1 用量。
带有 Cre 质粒的 DD-Cas9 也可获得，可用于基于 Cre-lox 系统的体内研究中遗传相互作用的分析。
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概述
本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9技术的基因组编辑工具，该工具可通过小分子Shield-1实现时间上和条件性的稳定。该方法适用于培养细胞和动物模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 基因编辑
背景
- CRISPR-Cas9 是一种广泛使用的基因组编辑技术。
- Shield-1 可实现对 Cas9 的可控激活。
- 降低脱靶效应和细胞毒性对于基因编辑至关重要。
- 该方法可促进对必需基因和肿瘤存活基因的研究。
研究目的
- 开发一种副作用更少的精确基因编辑方法。
- 实现同一启动子下多个基因的共表达。
- 支持在体外和体内研究中的应用。
使用的方法
- 利用 Shield-1 实现 Cas9 的稳定化。
- 温度控制的 CRISPR-Cas9 基因编辑。
- 与传统方法相比的脱靶效应和细胞毒性的比较。
- 在涉及血脑屏障研究中的应用。
主要结果
- 与组成型激活相比，脱靶效应更低。
- 在基因编辑应用中表现出较低的细胞毒性。
- 能够有效表征必需基因。
- 有助于研究参与大脑发育的基因。
结论
- 该方法为多种模型中的基因编辑提供了多功能工具。
- 它提高了CRISPR-Cas9应用的精确性和安全性。
- 未来的研究可利用该方法开展复杂的遗传学研究。
常见问题
行业重要性概述
通过 Shield-1 实现 Cas9 的条件性稳定化，可精确控制基因编辑的时间进程，从而在靶点验证工作流程中减少脱靶效应和细胞毒性。该方法通过允许独立操控等位基因并共表达目的基因而不影响第二个基因的调控，支持机制层面的风险评估。该系统增强了在体外和体内模型中对必需基因表征及肿瘤存活基因研究的预测可信度，包括在神经科学应用中穿透血脑屏障的研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过快速、依赖 Shield-1 的 Cas9 稳定化，实现对基因功能的探究，用于目标假设的验证。
- 操作价值：支持双顺反子表达系统，可将 DD-Cas9 与目的基因共表达，从而实现等位基因的平行且独立操控。
- 战略价值：可通过荧光蛋白标记（如 mVenus）构建可追踪系统，该标记独立于 DD-Cas9 表达，适用于谱系追踪。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：与组成型 Cas9 激活相比，该方法提供定量的、内部对照的基因编辑读数，并显著降低脱靶效应。
- 操作价值：支持标准化的 Shield-1 依赖性诱导窗口（例如，诱导 2 小时，6–12 小时后可忽略），适用于可重复的时间进程检测。
- 战略价值：支持可扩展的慢病毒载体生产与滴定工作流程，确保在不同细胞系中实现一致的转导效果。
转化与临床前研究
- 科学价值：由于Shield-1可在体内穿透血脑屏障，因此可用于研究脑发育相关基因。
- 操作价值：通过DD-Cas9-Cre质粒与Cre-lox系统兼容，可在复杂组织中模拟基因相互作用。
- 战略价值：通过可控的基因编辑动态，表征必需基因和肿瘤存活基因，从而实现基于风险评估的推进研究。
流程与工作流整合
该方法可整合至早期发现阶段以进行靶点验证，通过定量、时间分辨的编辑支持检测方法开发，并借助体内适用性及与生物标志物兼容的读出方式实现转化连续性。
- 发现生物学：通过条件性、Shield-1诱导的Cas9核酸酶活性支持假设验证，用于通路及基因功能的研究。
- 筛选：通过标准化的病毒转导、Shield-1滴定以及基于流式细胞术的GFP定量，实现检测就绪，评估编辑效率。
- 分析：实现对定量因变量的测量（例如GFP阳性细胞百分比、免疫印迹蛋白耗竭、Surveyor核酸酶介导的插入缺失检测），以比较不同条件下的编辑结果。
- 转化研究：通过体内适用性、血脑屏障穿透能力以及与Cre-lox系统的兼容性，支持在神经环路水平上开展基因互作研究，实现临床前研究的连续性。
- 企业级复用：可作为一个可重复使用的平台，用于在多个靶点、细胞类型和疾病模型中进行可诱导基因编辑，而无需对核心系统重新设计。
运营与企业影响
- 科学价值：与组成型 Cas9 相比，通过减少脱靶效应并提高内部对照，可在靶点验证中提供更具预测性的置信度。
- 操作价值：通过 Shield-1 依赖的诱导动力学、双顺反子载体设计以及稳定的病毒滴定工作流程实现标准化。
- 战略价值：通过实现时间控制以区分基因的原发性与继发性效应，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于必需基因和肿瘤存活基因表型，在降低混杂毒性的情况下，对靶点进行风险校正后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备慢病毒生产、滴度计算以及Shield-1剂量优化方面的专业知识，以实现DD-Cas9的稳定表达。
- 依赖流式细胞术、免疫印迹和Surveyor核酸酶分析等分析基础设施，用于定量编辑和蛋白敲除效率。
- 需要跨团队对Shield-1浓度、孵育时间及换液操作流程进行标准化，以确保可重复的诱导时间窗口。
- 涉及在不同模型系统（如HEK293T、A549）中的适应性考量，以及双顺反子共表达所需的启动子兼容性。
- 存在实际限制因素，例如高效转导是限速步骤，且需要低代次的HEK293T细胞以获得最佳病毒产量。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Lentiviral Preparation
2:47
Determining Virus Titer and Transduction Efficacy with Flow Cytometry
4:27
Lentiviral Transduction of Target Cells and Conditional Induction of Cas9 Mediated Gene Editing
6:06
Results: Analysis of Reversibility and Rapidity of Destabilized DD-Cas9 Protein
7:24
Conclusion
