固定化金属亲和色谱中金属浸出的定量分析

本方法具有重要意义，因为它能够使普通生物化学研究人员快速判断通过固定化金属亲和层析分离的样品是否被过渡金属污染。该方法的主要优势在于操作简便。该检测所用的仪器和实验技术在大多数生物化学实验室中均很常见，因此可以轻松且快速地实施。

尽管本文中采用镍-NTA柱纯化的样品进行该方法的应用，但该方法也可用于其他任何金属螯合亲和树脂。初次使用者应先使用已知浓度的镍标准溶液尝试该方法，以熟悉实验流程、样品颜色以及光谱变化中显示的树脂特性。

演示该实验操作的是我实验室的技术员 Cole Swain。首先，打开紫外-可见分光光度计并进行预热。使用带二极管阵列的紫外-可见分光光度计，在280纳米波长下通过光吸收来测定待分析的层析组分，以定量蛋白质含量。

取 pH 在 7 至 12 之间的 10 至 100 毫摩尔样品缓冲液，例如 Tris、HEPES、MOPS 和磷酸盐缓冲液。使用每毫升储备液 120 毫克 HNB 试剂，在样品缓冲液中配制 12%（质量/体积）的 HNB 分散液。将分光光度计设置为在 647 纳米波长处采集数据。

使用装有样品缓冲液的石英比色皿对分光光度计进行调零。在比色皿中配制对照溶液，每毫升总反应体积中含有50微升HNB储备液。将对照溶液在室温下孵育至少三分钟。

测定并记录对照样品在647纳米处的吸光度。通过将150微升HNB储备液与2850微升用样品缓冲液适当稀释的蛋白组分混合，制备检测样品。将样品在室温下孵育至少三分钟。

对每个待测组分重复进行光谱记录。若稀释不足，则在647纳米处的整个光谱带将消失；而若稀释过度，则样品与对照无法区分。

为确定每个样品中金属的浓度，首先计算各样品在 647 纳米处的吸光度与 HNB 对照之间的差值。使用以下公式确定以微摩尔为单位的金属浓度：其中 DF 为检测组分的稀释倍数，ΔA-B-S 647 为 647 纳米处的吸光度变化，3.65 × 10⁻² 表示 HNB 的摩尔吸光系数，l 为比色皿的光程（厘米）。本研究中展示了在中性 pH 条件下游离 HNB 的光谱，以及从 MSP1E3D1 分离过程中检测镍离子的代表性组分的光谱。

与HNB对照相比，在647纳米处观察到吸光度降低，这对应于在存在过渡金属的情况下形成了HNB复合物。为了展示该检测方法的应用，分析了两种带组氨酸标签的膜支架蛋白MSP1E3D1、MSP2N2，以及来自硫还原地杆菌（geobacter sulfurreducens）的一种新型含三个血红素的c型细胞色素GSU0105。对于GSU0105，其各组分中的蛋白质和镍离子含量显著分离；而MSP1E3D1和MSP2N2中蛋白质含量最高的组分也具有最高的镍含量。

本文还说明，使用金属螯合亲和层析收集的不同组分中，金属含量可能分布不均。最重要的是，在所有样品中充分且一致地混匀空白对照，并确保空白对照在所有样品中的孵育时间相等。对于特别关注的蛋白质组分，可进一步采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法（ICPMS）进行分析，以确认是否存在金属污染，并检测是否存在螯合或紧密结合的蛋白质金属离子。

除了可用于检测过渡金属的溶出外，该技术还可用于测定过渡金属离子与蛋白质之间的结合亲和力。HNB 以及样品中可能存在的镍分别对眼睛和皮肤具有刺激性。实验过程中应使用标准的个人防护装备，包括手套和护目用品。