分析靶抗原特异性治疗性抗体在肿瘤及组织中的分布

本方案展示了抗体的表达与纯化，以及抗体在肿瘤和组织中分布的实时监测。采用所述方案筛选抗体将有助于选择非特异性组织分布有限且在肿瘤中富集的抗体。所述技术快速且成本效益高。

其他技术，例如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描，成本高昂，且需要放射性及其他复杂的示踪剂。该技术不仅限于癌症靶向抗体，还可应用于其他任何疾病，如肺部或心脏疾病，用于分析抗体在体内的分布情况。

演示该实验操作的是来自我校的兽医技术员 Jeremy Gatesman。将 200 毫升培养基中的原始 CHO 细胞置于 Delong 型带挡板的锥形瓶中。在 15 毫升离心管中，将 5 毫升 CHO FreeStyle 培养基与 50 微克的可变重链克隆 DNA 以及 75 微克的可变轻链克隆 DNA 混合。

然后，涡旋混匀该离心管。将混合物在室温下静置5分钟。向DNA溶液中加入750 µL浓度为1 mg/mL的聚乙烯亚胺储备液，并剧烈涡旋混匀30秒。

将混合物在室温下再放置五分钟。在手动摇动烧瓶的同时，将全部混合物加入CHO细胞中。立即于37摄氏度、130转/分钟摇动条件下培养细胞。

第二天，向细胞中加入2毫升100倍浓度的防结块剂和2毫升100倍浓度的抗菌抗真菌溶液。将培养瓶置于32至34摄氏度条件下，以130转/分钟振荡培养。继续培养细胞10至11天，每隔5天添加10毫升胰蛋白胨N1培养液和2毫升100倍浓度的谷氨酰胺补充剂。

每隔三天计数细胞，以确保细胞活力保持在80%以上。在第10天或第11天，通过在4°C条件下以3000 × g离心40至60分钟，收获培养基用于抗体纯化。随后，使用0.22微米的瓶式滤器过滤澄清的培养基。为纯化抗体，用两倍柱体积的结合缓冲液平衡蛋白A柱。

以每分钟1毫升的流速将过滤后的上清液过柱。随后用两倍柱体积的结合缓冲液洗涤层析柱。用5毫升洗脱缓冲液将抗体洗脱至每管500微升的组分中。

通过每份加入10微升中和缓冲液，中和上述抗体的pH值。使用IgG的默认方案，通过分光光度计测定纯化抗体的浓度。取0.5毫升抗体，使用透析盒在1升偶联缓冲液中进行透析。

四小时后，将透析盒转移至新鲜缓冲液中，透析过夜。设置偶联反应时，在总共500微升的体积中，每1毫克抗体加入0.03微克的IRR染料800 CWU。在20摄氏度下孵育混合物2小时，然后通过在PBS中进行充分透析来纯化标记的偶联物。

通过测量染料在780纳米处的吸光度以及蛋白质在280纳米处的吸光度，估算标记程度。为建立小鼠异种移植模型，轻轻提起动物的皮肤并将其与下方的肌肉层分离。使用26号针头将100微升细胞悬液缓慢皮下注射。

拔出针头前等待几秒钟，使基底膜基质介质在皮下与细胞共同形成半固体凝胶状结构，以防止混合物从注射部位溢出。为进行活体成像，通过尾静脉注射标记染料的抗体。麻醉小鼠后，检查其足底反射是否消失，并通过应用温水使静脉扩张。

使用带有26号针头的1毫升胰岛素注射器，在100微升体积中注射25微克标记抗体。作为阴性对照，使用不靶向癌细胞的非特异性IgG同型抗体进行标记并注射。在抗体注射后的8小时、24小时和48小时进行活体成像。

在成像软件中，单击初始化。确认载物台温度为 37 摄氏度。在控制面板中，通过成像向导设置荧光成像，并将激发波长设为 773 纳米，发射波长设为 792 纳米。

将麻醉后的小鼠转移至成像室中，使用鼻罩将其固定在成像区域。准备就绪后，点击控制面板上的“采集”按钮开始获取图像，然后点击“自动曝光”。

生成的图像为荧光信号与光学照片的叠加，其中荧光强度和密度以计数或光子数为单位显示。通过菌落PCR确认了含有可变重链和可变轻链的阳性cDNA克隆。此处展示了纯化的farletuzumab在非还原和还原SDS-PAGE中的代表性结果。

重链和轻链经还原后分别产生50和25千道尔顿的条带。还证实了抗体与细胞表面天然蛋白的结合。将荧光标记的抗体经尾静脉注射至移植有高表达R1肿瘤的小鼠体内。

使用 IVIS 在多个时间点对动物进行活体成像。数据证实，完整的 R1 和 BaCa 抗体在肿瘤中具有选择性富集。在实施本方案时，需注意 CHO 细胞的培养维持对抗体产量至关重要。

对于竞争性肿瘤定位而言，保持荧光染料偶联程度相近非常重要。通过该方法处理后，可进一步开展其他实验，如组织免疫组织化学、组织或肿瘤特异性ELISA，以支持活体小鼠成像数据。