利用病毒衍生肽修饰抗体偶联物的初步评估：提高细胞摄取与增强肿瘤靶向性

这些实验步骤的总体目标是在抗体偶联物开发的初期阶段，评估其在靶细胞和肿瘤内聚集的特异性和有效性，以便最终应用于临床。该方法有助于回答偶联物研究领域的一些关键问题，例如细胞核定位的效率以及细胞内总体聚集情况。该技术的一个优势在于，研究人员可以通过PET成像来评估候选抗体偶联物的有效性和选择性。

这些技术的应用前景涉及癌症的治疗与诊断，因为肿瘤细胞摄取效率低下是抗体偶联物在这些应用中的主要限制因素。根据文本方案合成叶酸-核定位序列抗体偶联物后，用200纳米浓度的7G3叶酸-MLS抗体偶联物处理靶向TF1A细胞。同时设置经修饰的对照单克隆抗体处理的细胞作为对照。

将5 × 10⁶个抗原阳性细胞与偶联物在37°C下孵育1小时。然后去除上清液，用1 mL预冷的PBS洗涤细胞3次。加入新鲜培养基，在37°C下继续孵育细胞1小时。

接下来，加入含有0.25%胰蛋白酶和EDTA的0.5毫升PBS，将细胞在37摄氏度下孵育最多30分钟。然后使用含10%FBS的1.5毫升RPMI1640培养基中和胰蛋白酶。在500 × g下离心5分钟，弃去上清液，并用0.5毫升预冷的PBS再次洗涤细胞三次。

向细胞中加入 0.5 毫升含 1% PFA 和 1% 蔗糖的 PBS 溶液，冰上放置 30 分钟以固定细胞。随后用 0.5 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞三次，250 × g 离心 5 分钟。接着向细胞中加入含 0.15% Triton X-100 的 PBS 溶液，冰上透化处理 5 分钟。

然后用预冷的PBS洗涤细胞，并重复离心步骤。将细胞重悬于0.1毫升含有2微克/毫升Alexa Fluor 647标记的抗小鼠IgG多克隆二抗的PBS中，在室温避光孵育1小时。在250 × g下离心5分钟，用0.5毫升预冷的PBS洗涤细胞三次。

然后将细胞重悬于 0.5 毫升 PBS 中。向细胞中加入终浓度为 10 微克/毫升的碘化丙啶。随后取 1 × 10⁵ 个细胞，用封片剂将其滴加至玻片上，再用盖玻片封片。

使用倒置激光扫描共聚焦显微镜，配备 Plan APO 60X 油浸物镜（数值孔径 1.42）观察细胞。采用 488 纳米氩离子激光器，并将光谱扫描棱镜设置为 600 至 650 纳米，以检测 PI 荧光。对于 AF 647 荧光，使用 633 纳米氦氖激光器，并将光谱扫描棱镜设置为 650 至 700 纳米。

依次采集PI和AF 647的图像，图像大小为1024 × 1024像素，采用2倍线平均，以0.5微米的间隔贯穿整个细胞厚度进行采集。图像以Z投影形式呈现。分析细胞时，评估并记录细胞质内荧光是成簇且靠近细胞表面，还是弥散且均匀分布。

同时评估每个细胞的相对荧光强度。根据文本方案制备并浓缩放射性标记的结肠酸NLS抗体偶联物后，通过在ITLC试纸上点加0.5微升0.1摩尔pH 5.5柠檬酸钠溶液（即ITLC洗脱液）来测定放射标记效率。对试纸进行放射自显影，并获取数字图像。

进行密度测定以确定结合态与游离态铜-64的比例。若游离铜-64含量大于5%，则需进一步浓缩样品。对于铜-64细胞蓄积研究，按照先前所述方法，在37摄氏度条件下，分别用100纳米摩尔的铜-64标记A14偶联物处理细胞1小时、6小时和24小时。

用未修饰的 A14 处理细胞以阻断 IL5R alpha 细胞，并在 4 摄氏度条件下孵育以抑制受体介导的内吞作用。按照本视频前面演示的步骤，洗涤细胞并用新鲜培养基孵育后，加入含有 0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 的 0.5 毫升 PBS，于 37 摄氏度孵育 15 分钟。随后，如前所述中和并洗涤细胞，向细胞中加入质膜裂解缓冲液，在冰上孵育 10 分钟。

将质膜裂解的细胞在90 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，并将其转移至新的离心管中。此上清液即为胞质组分。

然后用预冷的PBS洗涤细胞核三次，并将洗涤液加入细胞质组分中。确保含有细胞核和细胞质组分的样品管已密封，随后将其放入针对铜-64校准的γ计数器中，以将原始计数转换为兆贝可（megabecquerel）。通过Western印迹法检测核内蛋白lamin AC和细胞质中丰富的蛋白Rab-7，对全裂解液、细胞核组分及细胞质组分进行分析，以评估细胞核分离的质量。

用500微升放射性免疫沉淀分析缓冲液（RIPA缓冲液）以及含有1%、2%和4% NP-40的质膜裂解缓冲液分别处理五次10的6次方个细胞。此外，用500微升RIPA缓冲液处理分离的细胞核，以获得分离的核蛋白。向分离的核蛋白、胞质蛋白和全细胞蛋白中加入四倍样品体积的冷丙酮，在-20摄氏度下孵育60分钟。

将样品在13,000 × g条件下离心10分钟。小心倾去上清液，避免扰动蛋白质沉淀。然后加入100 µL PBS以溶解蛋白质。

按照先前所述方法进行蛋白质印迹后，在40千道尔顿的分子量标记处将膜切成两半。使用针对lamin-AC的特异性抗体检测含有较高分子量蛋白质的印迹部分，使用Rab-7特异性抗体检测膜的下半部分。在包含四只nodskit小鼠的组别中，经尾静脉注射20至30微克放射性标记的A14胆酸-NLS抗体偶联物、放射性标记的A14 NLS以及放射性标记的A14。

同一天，将含有5兆贝可铜-64的圆柱形模体放入PET扫描仪中，以将每秒放射性计数转换为每克组织的注射剂量。48小时后，按照文本所述方案麻醉小鼠，迅速将小鼠以头部朝前俯卧位转移至PET扫描仪载物台上，并连接异氟烷鼻罩。采用常规采样模式设置和250至650千电子伏的能量窗，开始PET数据采集。

扫描完成后，将小鼠从扫描仪中取出，并放回笼中。如图所示，箭头指示了在有无胰蛋白酶消化情况下评估抗体偶联物积累的差异。在未进行胰蛋白酶消化的细胞中，由于靶细胞表面受体的过表达，难以评估细胞内积累和分布情况。

箭头显示了在细胞经过适当胰蛋白酶消化后，两种抗体偶联候选物在细胞内积累和分布的差异。放射性标记的 A14 胆酸-NLS 抗体偶联物对 IL5R α 具有纳摩尔级亲和力。随着放射性标记的 A14 胆酸-NLS 抗体偶联物浓度增加，该偶联物在 HT-1376 和 HT-B9 细胞中的特异性结合在浓度达到 3.5 纳摩尔时接近饱和。

伽马计数显示，放射性标记的 A14 结肠酸 NLS 抗体偶联物在细胞核和细胞质中放射性增加具有特异性，并随时间延长而升高。HT-1376 和 HT-B9 细胞用含 1%、2% 或 4% NP-40 的质膜裂解缓冲液进行孵育。对于 HT-1376 和 HT-B9 细胞，含 1% 或 2% NP-40 的裂解缓冲液中，Rap-7 在核组分中未被检测到，而核纤层蛋白 AC 在胞质组分中未被检测到。

PET成像可用于评估候选抗体偶联物靶向抗原阳性肿瘤（红蓝箭头所示）的能力，以及与未经肽段修饰的母体抗体相比的生物分布特性。通过观察肿瘤中信号的累积情况，有助于筛选具有开发潜力的抗体偶联物。PET成像还可用于评估候选抗体偶联物在肝脏等健康组织中的摄取情况。

掌握这些技术后，从事分子载荷靶向肿瘤递送领域的研究人员将能够探索其他因内体滞留而阻碍肿瘤细胞蓄积的药物。