利用整体免疫组织化学与三维重建技术对咽弓动脉进行可视化与分析

该方法可将每个咽弓进行区室化处理，随后可在每个咽弓中定量内皮细胞数量，以研究咽弓动脉的发育过程。该方法的主要优势在于能够直观显示不同血管结构之间的相互关系，并能够定量分析这些结构在突变体中的受影响情况。

主动脉弓动脉在先天性心脏病中常发生突变。我们的方法可用于研究突变如何影响血管形成与重塑的生理过程。尽管我们使用该方法来深入了解先天性心脏病的机制，但随着光片显微镜的发展，该方法也可应用于其他系统。

首先使用玻璃移液管将每只小鼠胚胎第9.5天或10.5天的胚胎转移至含有1毫升PBS的单独2毫升离心管中。固定后，用精细镊子在后肢上方轻轻夹住胚胎，并进行横向切割以去除胚胎的后半部分。为了使胚胎通透，将PBS更换为PBST，并将胚胎置于4°C条件下轻轻振荡过夜。

第二天，轻轻移除 PBST，每管加入 600 微升封闭缓冲液，避免触碰胚胎，在 4 摄氏度下轻柔振荡孵育 16 至 18 小时。次日早晨，将封闭缓冲液替换为每管 600 微升的目标一抗溶液，在 4 摄氏度下轻柔振荡孵育 4 至 5 天。孵育结束后，在室温下用 1 毫升 PBST 轻柔振荡洗涤胚胎 4 至 5 小时，每小时更换一次 PBS；随后在 4 摄氏度下用新鲜 PBST 过夜孵育，并于次日再进行 4 至 5 次每次一小时的洗涤。

最后一次洗涤后，将每管中的 PBST 替换为 600 微升相应的二抗溶液，在 4 摄氏度下孵育四至五天。孵育结束后，如前所述，每次用 1 毫升新鲜 PBST 洗涤胚胎，并用玻璃移液器将每个胚胎轻柔地转移至单独的塑料石蜡模具中。小心移除胚胎周围的 PBST，并将每个胚胎调整为矢状位。

然后迅速向每个模具中加入约 500 µL 热琼脂糖，直至每个胚胎刚好被覆盖，并将模具置于覆盖铝箔的冰上，直到琼脂糖完全凝固。对于胚胎样品的脱水处理，使用洁净的解剖刀在每个胚胎周围切下一块琼脂糖块，并用镊子夹取琼脂糖块，转移至含有 1 mL 25%甲醇的已标记 2 mL 离心管中。在避光条件下轻轻振荡孵育 1 小时后，将每管中的 25%甲醇更换为 1 mL 50%甲醇，继续在避光条件下孵育 1 小时。

脱水结束后，将100%甲醇替换为1毫升50%BABB，于避光条件下轻柔振荡孵育1小时。孵育结束后，将50%BABB替换为每管1毫升100%BABB，于避光条件下轻柔振荡孵育1小时，随后按照上述方法进行第二次100%BABB孵育。为胚胎成像做封片准备时，从快速固定垫圈上移除粘合剂，并将该垫圈放置于24乘6毫升的1.5号玻璃盖玻片上。

轻轻按压粘合剂，以去除盖玻片与缓冲垫之间的任何气泡，并小心弃去各管中的100% BABB。然后使用精细镊子小心地将胚胎转移至快速孔中，避免触碰胚胎，并将第二块盖玻片放置在缓冲垫上。为对整个第三咽弓的内皮进行表面成像，于软件中打开目标图像，点击“添加新表面”。

双击表面一，将新表面重命名为第三咽弓。选择跳过自动创建，手动编辑，并将表面方向设置为 YZ 平面。使用切片位置将第三咽弓表面平面放置在第三对咽动脉与背主动脉连接处。

旋转图像，使第三咽弓的表面平面可见，并关闭正交切片器。在绘制轮廓模式下，选择距离绘制模式功能，并根据需要调整参数设置。当所有参数设置完成后，按下 Esc 键，然后单击“绘制”，使用鼠标光标勾画第三咽弓的轮廓边界。

然后使用切片位置移动 10 到 25 个切片，并描记咽弓的周长。当整个咽弓描记完成后，单击“创建表面”以生成所描记区域的表面结构。对于已生成表面结构的区域进行掩膜处理，在编辑菜单中选择第三咽弓动脉和 DAPI 的掩膜选区，然后单击“确定”。随后将新通道重命名为 PAA DAPI。

对剩余通道重复此步骤。若要将内皮网状结构与PAA分别可视化，请选择第三个PAA的掩膜，并选择DAPI。取消勾选“选择表面外部体素”，并勾选“选择表面内部体素”。

将表面内部选定的体素设为零，然后点击确定。将新通道重命名为 non-PAA DAPI。对剩余通道重复此步骤。选择第三个 PA 的掩膜选择，并选择 non-PAA DAPI，然后点击确定。将新通道重命名为 plexus DAPI。

对剩余通道重复此步骤。为了量化每个感兴趣结构内的单个内皮细胞，在显示调整面板中，关闭除 PAA ERG 通道外的所有通道。在属性菜单下，点击“添加新斑点”，并将其重命名为“PAA 内皮细胞总数”。

单击蓝色箭头，为源通道选择 PAA ERG 通道。将估计的 XY 直径调整为四微米，然后单击蓝色箭头进入下一个面板。使用滑动标尺调整斑点数量，确保每个 ERG 阳性的内皮细胞核均由一个斑点表示。

接下来，单击绿色双箭头，在显示调节面板中关闭 PAA ERG 通道。开启 PAA VEGFR2 通道以显示 PAA 内皮结构，然后单击“编辑”并选择“添加/删除”，进而选择物体表面。随后按 Esc 键并按住 Shift 键，删除所有 VEGFR2 阴性的信号点，再单击“统计”标签以确定内皮细胞的总数。

整体免疫荧光染色可产生清晰干净的结果，从而实现咽弓内皮的三维重建。在本图像中，大而明亮的点状结构的出现是由于抗体或封闭缓冲液中存在颗粒物。在完成咽弓及PA血管表面染色后，使用掩膜功能可将表面区域在视觉上分离，并进行独立分析。

掩膜技术还可实现对每种结构内内皮细胞数量的单独分析与定量。例如，在此使用斑点功能，通过为表达 ERG 的每个细胞核分配一个单独的斑点，来定量 PAA 和血管网中的内皮细胞总数。在此图像中，可观察到由斑点功能生成的一个 ERG 阳性而 VEGFR2 阴性的斑点。

因此，必须验证软件识别的每个点确实代表一个单独的内皮细胞。为了获得清晰干净的图像，请记得将所有溶液离心沉淀，并在每次抗体孵育后对每个胚胎进行彻底且充分的洗涤。需要注意的是，BABB 具有腐蚀性和毒性。

妥善处理并丢弃溶剂，并确保完全密封已融化的胚胎，防止BABB渗漏。