三维与四维可视化及分析方法在脊椎动物体轴伸长与分节研究中的应用

小鼠胚胎的器官发生阶段由于胚胎复杂结构难以观察，目前研究仍不充分。本方案描述了可在体轴延伸和体节形成期间实现小鼠胚胎三维（3D）和四维（4D）可视化与分析的技术。该技术的主要优势在于，使研究人员能够将小鼠胚胎的复杂结构作为三维动态对象进行研究和展示。

本方案包含可用于研究影响哺乳动物椎骨和脊髓的先天性畸形（如脊柱侧弯）的技术。这些技术也可用于体外模型系统，从而实现对人类胚胎发育的研究。为对胚胎第8.25天至胚胎第10.5天的小鼠胚胎进行活体成像，需在37摄氏度预热的M2培养基中解剖胚胎。

使用洁净的镊子轻轻去除卵黄囊，并用新鲜的M2培养基洗涤胚胎一次，以清除解剖过程中产生的血液和碎片。在活体成像过程中，将胚胎孵育于添加了10% HyClone定义型胎牛血清、2毫摩尔L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素的低糖DMEM培养基中，置于37摄氏度加热培养室，且在65%氧气与5%二氧化碳的环境中。为了制备适用于免疫荧光显微镜观察的相似发育阶段小鼠胚胎，无需使用预热的M2培养基，而应在冷的PBS中进行胚胎解剖，并用4%多聚甲醛固定。

按照文中所述完成整体免疫荧光染色方案后，可使用 RapiClear 进行组织透明化。首先，将胚胎置于一个 75 × 25 毫米凹面载玻片的中央，移除显微镜凹面载玻片中的所有 PBST，并加入 200 微升透明化溶液，然后用盒子盖住玻片样本。避光放置 10 分钟后，当胚胎开始变得透明时，更换透明化溶液，并继续孵育额外 20 分钟。

从一侧开始，轻轻将盖玻片覆盖在胚胎上，并逐渐移向另一侧。样品现已准备好进行成像。若使用水杨酸甲酯或BABB进行透明化处理，需确保胚胎已在100%甲醇中完全脱水，然后开始BABB与甲醇的系列处理，每步增加20%浓度，并孵育20分钟。

当BABB溶液达到100%时，需更换两次新鲜溶液。准备一个20 × 60毫米的1.5号盖玻片用于封片，以避免压扁样本。添加由薄金属垫片制成的间隔物。

使用牙签、细棉签或巴斯德移液管将透明化的胚胎转移至显微镜载玻片上。然后加入一滴封片剂，盖上另一块相同的盖玻片，并用熔化的石蜡密封，以更好地稳定样品并避免产生气泡。将盖玻片从一侧轻轻放置，然后逐渐且缓慢地侧向滑动，必要时可添加更多封片剂。

样本现已准备好用于显微镜成像。成像后，使用 Fiji/ImageJ 将胚胎重新定位至标准化的前后轴和背腹轴方向。在 Fiji 中减小图像数据集的大小，然后进行缩放，并输入必要的 X、Y 和 Z 轴比例值，以将数据集减小到 200 兆字节以下。

确保勾选“创建新窗口”选项。然后进入插件菜单并打开3D Viewer。在3D Viewer窗口中，单击胚胎以选中它，此时将出现一个红色的3D方框。

使用此模式时，用鼠标控制数据集的旋转。在确保胚胎处于理想位置后，选择编辑，变换图像，然后在3D查看器窗口中导出变换后的图像。检查不同的正交切面，然后转到图像，再选择堆栈并选择正交视图。

当胚胎位置正确后，选择 3D Viewer 窗口菜单，然后依次点击编辑、变换，并将变换矩阵保存为扩展名为 mat 的文本文件。使用 Fiji/ImageJ 打开该文本文件，删除前两行后重新保存。这样即可生成与 TransformJ 插件兼容的变换矩阵文件。

切换到全分辨率数据集，执行插件 TransformJ 和 TransformJ 仿射变换操作。在新窗口中，浏览并查找之前保存的矩阵文件，选择三次B样条插值法，并进行各向同性重采样，然后点击确定。在胚胎被正确重新定位后，裁剪掉大部分生成的空白区域。要生成完整的Z轴投影图像，请点击图像堆栈（stacks）、Z投影（Z Project），并选择最大强度投影。

然后绘制包含整个胚胎在 X 和 Y 方向上的最小 ROI。通过点击编辑、选择、恢复选择，并选择图像进行裁剪，切换到原始数据集的图像窗口。选择图像并打开图像栈，点击工具，选择切片移除工具，指定要移除的第一个和最后一个切片，确保将步长更改为 1，以修剪不与胚胎组织相交的起始和结束切片。如有需要，可按照文稿中的说明进行进一步分析和 3D 重建。

为了对发育较完全的胚胎进行三维分析，需在冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中解剖胚胎第18.5天的胎鼠，去除所有胚外膜，然后用新鲜PBS多次洗涤胎鼠，以清除解剖过程中产生的血液和碎片。将胎鼠置于PBS配制的4%多聚甲醛（PFA）中，于4°C固定5至7天。用PBS多次洗涤胚胎后，通过在甲醇溶液中逐级递增浓度（每次增加10%）的方式对胎鼠进行脱水处理，直至达到100%甲醇。

在室温下于摇床上每步孵育25分钟。接着，将胚胎分别在摇床上先用含5%过氧化氢的甲醇溶液孵育1天，再用含10%过氧化氢的甲醇溶液孵育最多3天，直至胚胎完全失去天然色素。随后在去离子水中用逆向甲醇梯度逐步重水化，每次在室温下于摇床上孵育20分钟，然后将胚胎在去离子水中洗涤3次，每次洗涤30分钟。

为了将胚胎包埋在1%琼脂糖块中，先将熔化的琼脂糖注入50毫升塑料管或注射器内，然后将胚胎垂直放入琼脂糖中，并在琼脂糖凝固过程中用镊子保持其垂直位置。将带有琼脂糖块的模具置于4摄氏度环境中30分钟，使琼脂糖充分凝固，随后将含有胚胎的琼脂糖块从模具中取出，放入盛有去离子水的容器中。使用甲醇浓度每步递增10%的溶液（以去离子水或PBS稀释）逐步进行胚胎脱水处理，在摇床中室温孵育，每步至少保持45分钟，直至甲醇浓度达到100%。

将胚胎依次通过一系列BABB溶液和甲醇进行处理，每种浓度处理2.5小时，BABB浓度每次增加25%，直至达到100% BABB。每天更换新鲜的BABB溶液，直到胚胎完全透明为止。此过程可能需要三到五天。

使用胶水将透明化的琼脂糖块固定在OPT扫描仪的电机轴上，然后调整光学系统以获得整个胚胎的图像，并继续采集完整的投影数据集。4D活体成像技术可实现对LuVeLu报告基因表达及胚胎第8.5天Snai1条件性敲除胚胎的动态分析。除了在体节前中胚层上出现正常的LuVeLu信号外，Snai1条件性敲除胚胎还在从原条延伸出的异位隆起区域表现出LuVeLu表达。

整体免疫荧光检测可用于识别潜在的神经中胚层前体细胞（NMPs）以及中胚层分化的重要调控因子。白色和黄色箭头标示了突变体与野生型胚胎之间的差异。对整体免疫染色样本进行三维重建，有助于更深入理解所研究的组织或结构。

在此情况下，研究了尾芽中潜在NMPs的位置。三维组织重建对于理解与表征小鼠胚胎中的形态学缺陷也具有重要意义。三维重建的交互式可视化也可以以用户友好的格式构建。

例如，在PDF文件中。这些三维胚胎尾部结构可用于向更广泛的受众展示三维模型的强大功能，并有助于教学和研究脊椎动物的轴向伸长与分节过程。最后，利用OTP显微成像技术，可以实现对更晚期小鼠胚胎的完整三维可视化。

此处展示的是动画渲染图像，突出显示了胚胎第18.5天胎儿的关键切片。最重要的是，结果必须真实反映在胚胎中观察到的内容。研究人员可利用这些方法，不仅呈现静态图像，还可包含视频、三维重建图像，甚至其数据的交互式3D模型。