体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

本实验方案利用体外区室化技术及一种独特的定向进化筛选策略，可构建出具有改变且更严格序列特异性的限制性内切酶。该方法具有潜在的普适性，因其可适用于任何限制性内切酶，并且筛选可针对原始识别序列的任何更严格变体进行。若新构建的变体通过体外转录-翻译系统表达，则该方案不仅适用于缩小酶的特异性范围，还可用于改变其特异性。

确定亚饱和突变的位点时，应根据这些位点假设的重要性选择相应的突变频率，同时需考虑整个文库复杂性的限制。开始合成时，将装有新树脂的柱子插入合成仪中。在所有柱子中合成寡核苷酸，直至从三端开始计数的第二个亚饱和突变位点之前的三联体。

合成时在5'端保留三苯甲基保护基。该保护基将在下一个合成周期开始时被去除。打开合成柱，短暂离心至干燥的1.5毫升离心管中以收集树脂。

取出CPG合成载体，并通过涡旋振荡混匀。将混合后的CPG树脂重新分装至新的合成柱中。避免引入湿气，因为湿气会降低总产率。

从亚饱和突变位点的三联体开始继续合成。根据所需的突变频率，将列分配给随机化的 NNS 三联体或野生型三联体。如果存在其他亚饱和位点，则仅进行到下一个亚饱和突变位点之前的三联体为止。

如果下游不再有亚饱和位点，则完成合成，末端保留5'三苯甲基基团。使用宽口吸头，在15毫升锥形管中，将225 µL Span 80和25 µL Tween 80加入5毫升矿物油中，配制油相表面活性剂混合液。轻轻倒置混匀15次，确保充分混合。

此步骤中的混合物应呈半透明状。对于每个文库，将950微升油性表面活性剂混合物转移至一个2毫升圆底冷冻管中。用文库名称标记，并置于冰上。

在每个小瓶中放入一个小型圆柱形搅拌子。根据生产商的建议配制体外转录-翻译反应混合液。向该混合液中添加氯化镁，使其终浓度为 1.5 毫摩尔。

将反应混合物分装至预冷的1.5毫升离心管中，每管50微升，置于冰上。在冰上向反应混合物中加入1.7飞摩尔的文库。通过将装有冰的小烧杯放置在磁力搅拌器上，并将搅拌速度设定为1150转/分钟，依次为每个文库制备水包油乳液。

然后将装有950微升油-表面活性剂混合物和一根小型搅拌子的冷冻管转移至磁力搅拌器上的冰浴烧杯中。检查搅拌子是否正常旋转。在两分钟内，每隔30秒加入一次体外文库转录-翻译混合物，共加入五份，每份10微升，之后继续搅拌1分钟。

将装有乳液的小瓶转移至冰容器中。此时，液体应呈不透明状，而非半透明状。随后，继续进行下一个文库的操作。

在处理完所有文库后，根据试剂盒制造商的建议开始对所有文库进行孵育。将小瓶转移至工程核酸内切酶的最适反应温度下继续孵育额外两小时，随后置于冰上至少10分钟。将乳液从冷冻小瓶转移至1.5毫升离心管中。

加入1 µL 5摩尔的EDTA。在室温下以13,000 ×g离心5分钟。如果离心后无法清晰看到水-油界面，可在吸除上层油相前将混合物冷冻。

用移液器移除上层油相并弃去。立即向水相中加入150微升苯酚-氯仿和100微升10毫摩尔/升Tris-HCl，进行提取。涡旋混匀后，在13,000 × g条件下离心30秒以实现相分离。

收集上层水相。加入15微升3摩尔的醋酸钠、2.5至5微克糖原和375微升乙醇，沉淀DNA。将样品在-20摄氏度孵育1小时后，在4摄氏度下以13,000 ×g离心15分钟。

弃去上清液，用1毫升冰冷的70%乙醇短暂洗涤沉淀。将DNA糖原沉淀在真空浓缩仪或空气干燥器中干燥超过五分钟。然后将沉淀溶解于50微升10毫摩尔/升Tris-HCl中。

接下来，加入5 µL链霉亲和素磁珠（按制造商说明书预先配制），在室温下混匀1小时，建议使用旋转混匀仪或轻轻涡旋混合。将离心管转移至磁力架上，使磁珠分离。

然后收集富含DNA但不含生物素的液体。该方案是一种通过去除无活性的酶以及具有未改变的野生型序列特异性的内切酶，来提高工程化限制性内切酶中目标变体出现频率的工具。成功的筛选可鉴定出高达20%的有前景变体。

如果突变体产生的切割模式与野生型酶不同，则将其标记为有前景的突变体。那些可能具有改变的序列偏好的突变体也会被标记。此处展示的是一次不成功的筛选，其中大多数突变体无活性，且有一个突变体的切割模式明显未发生改变。

在这种情况下，文库很可能主要包含未激活的变异体，这些变异体逃逸了链霉亲和素捕获筛选步骤。必须精心设计筛选和反向筛选的序列，并通过诱变策略限制文库的多样性，该策略仅在少数选定位置引入替换。应根据初始筛选结果，对所选出的最佳变异体在优选序列和非切割序列上的结合与切割动力学进行充分表征。

在我们的测试案例中，突变位点是基于同源建模来选择的。令人惊讶的是，后续的晶体结构显示，一些被改变的残基最可能并未直接与DNA接触。