在Saccharomyces cerevisiae中的定向进化方法：突变文库的构建与筛选

本实验方案的总体目标是展示如何在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中构建和筛选突变文库，以用于定向进化实验。该方法有助于解决实验室中开展聚焦式定向进化实验的关键问题，例如如何在片段组装与克隆过程中确定重叠区域。该技术的主要优势在于其简单性和稳健性，仅需一步转化即可获得高质量的产物。

本方案将演示如何构建和筛选突变体文库，以真菌芳醇氧化酶（AAO）为例。首先借助计算算法，基于该酶已有的晶体结构或同源建模结果，选定定向进化的靶向区域。将对AAO的两个区域进行随机诱变和重组：M1区域和M2区域。

将进行诱变PCR以扩增靶向区域。为了促进酵母体内的体内拼接，在每个约50个碱基对的片段之间通过重叠PCR反应产生重叠区域。准备50微升体积的诱变PCR反应体系，每一体系包含46纳克DNA模板、每种正向和反向引物各90纳摩尔、dNTPs 0.3毫摩尔、3% DMSO、氯化镁1.5毫摩尔、氯化锰0.5毫摩尔，以及Taq DNA聚合酶0.5单位/微升。

使用以下PCR程序：95摄氏度预变性2分钟，随后进行28个循环：95摄氏度变性45秒，50摄氏度退火45秒，74摄氏度延伸45秒，最后74摄氏度终延伸10分钟。AAO基因的其余部分，即高保真（HF）区域，将通过高保真PCR扩增，扩增时包含与突变片段重叠的相应区域，以及线性化载体的突出末端。

在终体积为 50 微升的反应体系中配制高保真 PCR，其中包含 10 纳克 DNA 模板、正向和反向引物各 250 纳摩尔、dNTPs 0.8 毫摩尔、3% DMSO 以及 iProof 超高保真 DNA 聚合酶 0.2 单位/微升。采用以下 PCR 程序：98 °C 预变性 30 秒；随后进行 28 个循环：98 °C 变性 10 秒，55 °C 退火 25 秒，72 °C 延伸 45 秒；最后 72 °C 终延伸 10 分钟。

然后根据生产商的说明书，使用商业化的胶回收试剂盒纯化所有PCR片段。下一步是线性化载体，以产生约50个碱基对长度的侧翼区域，这些区域与目的基因的5'端和3'端同源。配制一个20微升的线性化反应体系，其中包含2微克DNA、7.5单位BamH-one、7.5单位XHO-one、20微克BSA以及2微升10x BamH-one缓冲液。

将反应混合物在 37 摄氏度下孵育 2 小时 40 分钟。随后，在 80 摄氏度下反应 20 分钟以终止反应。为纯化线性化载体并避免残留的环状质粒污染，将消化反应混合物加入半制备型低熔点琼脂糖凝胶的加样孔中。

取五微升反应混合物加入相邻加样孔中作为报告样本。在电极间以每厘米5伏特、4摄氏度条件下进行DNA电泳。随后切下对应大加样孔的琼脂糖凝胶，置于含1倍XTAE缓冲液的4摄氏度环境中保存。

用分子量标准和报告基因对泳道进行染色。在紫外光下观察条带，并在已线性化的载体所在位置做切口。在无紫外光条件下，根据染色报告基因泳道中切口的指引，识别大孔中的线性化载体片段并将其切下。

从琼脂糖中提取线性化载体，并根据生产商说明书使用商业化的胶回收试剂盒进行纯化。随后，将纯化的线性化载体与PCR片段混合，将该DNA混合物利用商业转化试剂盒按照生产商说明书转化感受态酵母细胞。将转化后的细胞涂布于SC缺失培养基平板上，在30摄氏度下培养三天。

为准备该检测，从 SC 缺陷培养基平板上挑取单个菌落，并转移至含有 96 孔板的微孔中，每孔含 50 微升最小培养基。在每块板中，将第 6 列接种亲本类型作为内部标准。作为阴性对照，将 H1 孔接种含有尿嘧啶的 SC 培养基，其中接种无质粒的 URA3 阴性 ESI 体细胞。

将培养皿盖上盖子，用封口膜包裹，并在30摄氏度的湿润摇床中孵育48小时。48小时后，向每个孔中加入160微升表达培养基，并重新密封培养皿。继续孵育24小时。

离心后，使用液体处理机器人多通道工作站将每块板中各孔的20 µL上清液转移至复制板中。向每个孔中加入20 µL 2 mM对甲氧基苄醇和100 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）。用96孔板振荡器短暂混匀，并在室温下孵育30分钟。

随后，向每块复制板中加入 160 µL 的 FOX 试剂，并用混匀器短暂搅拌。使用酶标仪在 560 nm 处读取吸光值。将酶标板在室温下孵育至显色完全。

再次测量吸光度。相对活性通过每个培养板在孵育后的吸光度值与初始测量值之差，相对于亲本型进行归一化计算得到。该代表性凝胶图像显示：第二泳道为线性化载体，第三泳道为M1 PCR片段，第四泳道为M2 PCR片段，第五泳道为HF PCR片段，第六泳道为在体内重组后经NHE I线性化的载体。

下一张凝胶图显示了第2道为重新组装载体的质粒小提产物，第3道为用NHE I线性化的质粒，第4道为用BamH I和XHO I双酶切线性化的质粒，第5道为通过凝胶回收和纯化获得的线性化质粒。通过采样具有不同突变谱的突变文库来调整突变负荷，计算酶活性低于亲本酶10%的克隆数量，并通过对有活性和无活性变异体的随机样本进行测序进一步验证。对该检测方法检测限的评估表明，在存在山梨醇的情况下，该检测呈线性关系，以黑色圆圈表示。

在以空心方块表示的无山梨醇条件下，线性关系更为持久，但响应较弱。AAO 浓度与吸光度之间呈现出线性相关性。利用该检测方法构建并筛选了一个包含 2,000 个克隆的突变体文库。

阴影方块表示对对甲氧基苄醇具有显著增强的分泌能力和活性的AAO突变体。一旦掌握该技术，若操作得当，可在约四小时内构建突变文库。在进行该操作时，需注意为每一对PCR家族片段和线性化载体分配适当的重叠区域，以便通过单次转化实现体内拼接与克隆。

采用类似的方法，还可以进行体内DNA取样、饱和突变文库构建或DNA组装等实验，以构建突变文库和（或）代谢通路。该技术发展之后，为生物工程领域的研究人员探索蛋白质活性、稳定性，甚至设计无限种类的分子相互作用提供了可能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）系统进行文库构建与筛选。