利用小发夹RNA在C2C12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

本方案具有重要意义，因为它使我们能够研究在成肌管形成或成熟后期上调的蛋白质（如细胞外基质蛋白）的功能。该方法可通过使用特异性shRNA及相应的表型分析工具，在C2C12细胞中敲低任何目的基因。该方法的主要优势在于，我们已构建出能够在成熟成肌管中持续抑制目的基因的C2C12细胞系。

该实验步骤最关键的环节是保持C2C12细胞处于未分化状态，即在常规细胞培养过程中维持较低的细胞密度。转染前一天，将每毫升5×10⁴个C2C12细胞接种于6孔板中，每孔加入2毫升完全DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下过夜培养，使细胞融合度达到40%至50%。次日早晨，为每个培养孔准备一个1.5毫升离心管，每管中加入100微升25毫摩尔氯化钠溶液，并加入25.5微升未分化C2C12细胞培养物的PEI储备液，于37°C孵育5分钟。

接下来，将三微克质粒DNA与每孔100微升25毫摩尔氯化钠溶液混合，在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，将每份稀释后的PEI试剂全部体积与对应的稀释质粒溶液通过轻柔吹打混合，于37摄氏度孵育25分钟。孵育期间，将C2C12细胞培养物的上清液更换为不含抗生素和血清的DMEM培养基。

孵育结束时，将每种转染混合物的全部体积以滴加方式加入到每个孔中，同时持续移动细胞培养皿。在细胞培养箱中孵育六小时后，将每孔中的培养基更换为完全DMEM。转染24小时后，将每孔中的完全DMEM更换为添加了5微克/毫升嘌呤霉素的筛选培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养10至14天，或直至观察到稳定的C2C12细胞。

然后，在含有每毫升5微克嘌呤霉素的低密度培养条件下扩增嘌呤霉素抗性的C2C12细胞，并将6至10管细胞冻存以备后续使用。为诱导C2C12细胞分化，将1.5 × 10⁵个稳定的嘌呤霉素抗性C2C12细胞接种于12孔板中，每孔加入1毫升筛选培养基，于37°C、5% CO₂条件下培养，直至细胞融合度达到95%。为诱导分化，使用配备相机的倒置明场显微镜观察肌管形成后，每隔两天将每孔中的培养基更换为无血清DMEM。

对于分化细胞的肌球蛋白重链免疫染色，将五乘以十的四次方个嘌呤霉素抗性C2C12细胞接种至八孔腔室载玻片的每个孔中，每孔加入500微升完全DMEM培养基，然后将细胞放回细胞培养箱中。当细胞达到95%融合度时，将每孔中的筛选培养基更换为500微升无血清DMEM。在适当的实验时间点，用PBS缓冲液洗涤各孔中的分化细胞，每次5毫升，共洗涤三次，然后每孔加入200微升含4%多聚甲醛的PBS溶液进行固定。

孵育15分钟后，用新鲜的PBS洗涤细胞，每次洗涤均按上述方法进行，共洗涤三次，随后每孔加入200 µL PBS中的5摩尔甘氨酸，孵育5分钟。孵育结束后，再次洗涤细胞三次，然后每孔加入200 µL PBS中含1%非离子型表面活性剂的溶液，孵育10分钟以通透细胞。接着，每孔加入200 µL PBS中含5%牛血清白蛋白的溶液，室温孵育1小时以封闭非特异性抗体结合位点，随后用PBS洗涤三次。

最后一次洗涤后，在室温下用200微升肌球蛋白重链抗体标记细胞，孵育两小时。经过三次PBS洗涤后，将细胞与相应的二抗在室温下避光孵育两小时。最后再进行三次洗涤，吸去PBS，加入一滴含DAPI的封片剂，并加盖盖玻片封片。

然后使用荧光显微镜并配合适当的滤光片组观察每个小室。为了通过蛋白质印迹法评估细胞培养物中的基因敲低效率，首先将三份每份10的5次方个嘌呤霉素抗性C2C12细胞分别接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基。24小时后，用PBS洗涤细胞，并如图所示用2 mL无血清DMEM诱导细胞分化。

在适当的实验时间点分析分泌蛋白时，从每个孔中收集一毫升无血清的条件培养基，分别加入到1.5毫升的离心管中进行离心。离心后，将一毫升条件培养基上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并每管加入391微升非离子型表面活性剂中的三氯乙酸沉淀蛋白。涡旋混匀30秒后，将混合物置于冰上孵育10分钟。

孵育结束后，通过离心收集沉淀的蛋白质，并用预冷的新鲜丙酮洗涤蛋白沉淀，每次洗涤后离心，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将沉淀在室温下空气干燥三至四分钟，然后每管加入50 µL SDS-PAGE上样缓冲液重悬。随后将样品在95 °C下煮沸5分钟，再按照标准操作流程进行Western印迹分析。

对于细胞内和膜结合蛋白的分析，每孔使用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞层，并用细胞刮棒在每毫升PBS中轻柔地刮下细胞。将细胞转移至各1.5毫升离心管中，离心后用每管一毫升PBS洗涤三次，每次均通过离心进行。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于200微升裂解缓冲液中，缓冲液中需添加无EDTA的蛋白酶抑制剂混合试剂，在冰上孵育30分钟。

孵育结束后，将样品置于冰上，以23千赫兹的工作频率和10的输出功率超声处理15秒，然后通过离心去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升反应管中，根据标准方案测定蛋白浓度。每份样品中取100微克蛋白，加入5X SDS-PAGE上样缓冲液，总体积为60微升，于95摄氏度加热5分钟。

然后通过蛋白质印迹法分析样品中是否存在目标蛋白。由于非耐药细胞被有效清除，转染后10至14天内即可完成对嘌呤霉素耐药的C2C12细胞的筛选。通常在此期间，超过80%的C2C12细胞会从细胞培养皿上脱落，并在常规细胞维护过程中被去除。

表达对照或ADAMTSL2 shRNA的嘌呤霉素抗性C2C12细胞在低细胞密度下保持其纺锤形、细长的细胞形态，以及分化为成肌细胞的能力。通过撤除血清诱导C2C12细胞分化后，可利用明场显微镜和针对成肌细胞标志物——肌球蛋白重链的免疫染色进行监测。在诱导分化后3至5天可观察到肌球蛋白重链阳性的成肌细胞，这些成肌细胞为多核细胞，表现为细胞边界内存在一个以上的DAPI阳性细胞核。

如增殖条件下的基因表达数据所示，转染的基因敲低效率为40%至60%。可通过Western blot分析来验证基因敲低是否成功，例如，比较稳定表达靶向ADAMTSL2的shRNA的C2C12细胞与表达对照shRNA的细胞所获得的细胞裂解液。在筛选过程中，务必保持足够高的嘌呤霉素浓度，以清除所有未转染的C2C12细胞，否则未转染的细胞可能会过度生长并取代已转染的细胞。该检测方法使我们能够确定在肌肉发育后期表达的细胞外基质蛋白的功能，即使这些蛋白是在C2C12细胞分化后五到十天才被诱导表达的。

请注意，RNA 提取试剂和β-巯基乙醇应在通风橱中操作，并按照适当的安全规程处理三氯乙酸。感谢观看，祝您的实验顺利成功。