利用定性和定量组织学方法分析小鼠胚胎中的先天性心脏缺陷

本方案标准化了新的组织分析技术，以便其他研究先天性心脏缺陷的团队能够更广泛地应用。由于定性与定量分析技术各有优缺点，本方法结合两者，以应对最广泛的实验问题。这些技术可对心脏病学诊断方法产生积极影响。

例如，病理学家可将我们的显微心脏组织分析技术应用于心内膜心肌活检样本中人类心脏病的诊断。该方案可用于发育心脏病学或普通心脏病学研究。然而，这些方法还提供了多种实用技术，可广泛应用于各类组织分析。

为了获取胚胎第15至15.5天的心脏，固定怀孕母鼠的四肢，并从尿道区域开始沿躯干向上至胸骨，小心地做“I”形切口。使用镊子以舀取动作轻轻将子宫从腹腔中提起，必要时用精细镊子夹住子宫表面组织以协助取出。使用剪刀将子宫从腹部分离。

将子宫浸泡在冰冻的 PBS 中后，将其固定在解剖皿中。使用剪刀将子宫切成多个独立片段，每个片段包含一个单独的胚胎。使用两把精细镊子，轻轻将胚胎从子宫组织中剥离，并放入含有 4°C PBS-EDTA 的新培养皿中。

为获取心脏，将培养皿置于解剖显微镜下，使用两把精细镊子将胚胎置于仰卧位。固定并暴露胸腔后，用第二把精细镊子的尖端沿胚胎胸骨从锁骨之间向脐部做切口。在逐渐向胸腔内部操作时，进行非常精细且表浅的切开，打开胚胎的腹腔。

当心脏刚刚可见时，用一对镊子轻轻挤压紧贴肋骨的躯干，使肋骨张开。用其中一把镊子的侧面轻轻夹住肺部血管，不要分离组织，将心脏从体腔中拉出。将心脏在新鲜的PBS-EDTA中清洗1至2分钟，然后在4%多聚甲醛中固定45至60分钟。

然后，用添加了甘氨酸的 PBS 溶液洗涤心脏，每次洗涤 5 至 10 分钟，共洗涤三次。在将心脏置于 4°C 的 PBS 中保存之前，为准备进行冷冻切片，将样品放入含有 30% 蔗糖和 PBS 的离心管中，于 4°C 下孵育 24 至 40 小时。

当心脏沉至管底后，使用带有改良尖端的巴斯德移液管，小心地将每颗心脏转移至无绒擦拭纸上。短暂空气干燥后，将每个样本按所需的切片方向放入独立的OCT包埋模中。将组织浸入OCT包埋剂中，确保无气泡。

然后，将模具在 20 摄氏度下储存数天，随后将组织在 -80 摄氏度下冷冻至少 24 小时，再进行冰冻切片。为获得样品的冰冻切片，使用新鲜的最适切削温度介质将目标组织块固定于冰冻切片机的持样器上，并等待介质冻结至呈现不透明的白色。安装新刀片，并调节组织块与刀片之间的距离，以便获取切片。

将组织块切成10微米厚的切片，直至到达目标区域。当观察到组织时，使用小的平头画笔轻轻将切片拉向支撑架，保持连续切割动作。一旦组织被完全切开，使用细节画笔将切片轻拍平整，紧贴于载片台上。

在移除精细毛刷并完成切片前，将切片固定在原位约20至30秒。使用两把毛刷轻轻将切片压平贴附于载物台上，防止卷曲，并将组织切片紧贴载物台固定。20至30秒后，翻转切片，再次将其压平贴附于载物台上，然后将带静电的载玻片移至足够近的位置，使切片被吸引并黏附到载玻片上，而无需将载玻片接触载物台。

为了评估心脏组织切片中是否存在常见的心脏缺陷，使用配备相机的显微镜，以5至10倍和40倍的放大倍数获取图像。进行心肌致密化分析时，在合适的图像分析软件程序中打开感兴趣的组织图像，并将图像设置为8位。为设定图像的阈值，点击“Image”（图像）、“Adjust”（调整）和“Threshold”（阈值），移动顶部滑块调整阈值，直至仅选中背景像素。

接下来，使用多边形选择工具在组织周围绘制一个感兴趣区域，然后点击“分析”、“设置测量值”、“面积”和“限定于阈值”。点击“分析”和“测量”，以测量高亮像素的面积，从而获得负空间面积的数值。要测量整个感兴趣区域的面积，请点击“分析”、“设置测量值”，并取消选择“限定于阈值”。

然后，选择“分析”和“测量”，以测量所选感兴趣区域的整个面积。要计算肌肉组织面积，需从感兴趣区域面积中减去空白区域面积。然后将肌肉组织面积除以感兴趣区域面积，以计算肌肉致密度和X。对收获的胚胎心脏组织切片进行染色，可提供足够的对比度以清晰分辨组织边缘，但又不会过深而使细胞结构无法分辨。

在此代表性分析中，与在非实验条件下发育的胚胎相比，实验组心脏的肌肉压实程度明显降低。这些样品十分珍贵，且需要长时间制备。在尸检和冷冻切片过程中，务必确保每一个操作都准确无误。

用多聚甲醛保存组织可维持抗原活性，使样本可用于诸如氨基荧光素染色等检测，从而有助于在形态学评估过程中识别病理原因。在我们的实验室中，我们获得了实验处理的定量表征，这有助于我们确定不同处理对样本的影响程度。多聚甲醛能够固定其接触到的任何组织。

操作该化学品时，务必始终佩戴手套以尽量减少皮肤暴露，并在通风橱中进行操作。