利用基于细胞的雌激素受体β报告基因检测法筛选植物雌激素

我们使用该检测方法来评估植物性食物是否含有植物甾醇，这些物质可能影响动物的生理过程以及行为和繁殖成功率。该检测方法为确定植物是否产生具有生物活性的雌激素类化合物提供了一种简单且可靠的手段。该方法最初是为筛选具有外源性雌激素活性的药物以用于医学领域而开发的。

例如，抑制细胞增殖。我们利用该方法深入研究灵长类动物的生态学与进化。在进行本实验之前，务必在洁净环境中练习无菌操作技术，因为该实验对污染极为敏感。

首先使用冷冻干燥机对新鲜植物样品进行冻干处理，然后用带有0.85毫米筛网的研磨机将样品充分研磨成细粉。将研磨后的样品装入袋中，避光保存直至提取。为提取植物中可能含有的植物甾体，将干燥的样品加入适当大小的烧瓶中，随后加入高效液相色谱级甲醇。

用铝箔覆盖植物甲醇溶液，并置于旋转摇床中，以100转/分钟的速度旋转三天。三天后，使用滤纸将上清液倾析至滴滤装置中。使用旋转蒸发仪将植物提取物浓缩至呈浓稠状但仍可倾倒的状态，收集于300毫升圆底烧瓶中。

将样品倒入50毫升的烧瓶中，用少量甲醇冲洗大烧瓶，然后继续在小烧瓶中干燥样品，直至甲醇完全蒸发。完成后，用分析天平称量样品残渣并记录质量。将植物提取物以每0.1克提取物溶于2毫升DMSO的浓度溶解于DMSO中，并涡旋振荡至均匀。

DMSO 本身无毒，但它是一种可使其他物质穿过膜的溶剂。由于我们并不知道植物是否含有有毒化学物质，因此所有植物均被视为具有潜在危险性。切勿让溶液接触皮肤，若手套被污染应立即更换，并穿戴厚实的、包脚趾的鞋子和实验服。

将样品储存于棕色玻璃小瓶中，置于 4°C 下，直至准备使用。涡旋混匀样品，然后将每份样品各 4 µL 加入 496 µL 化合物筛选培养基中，配制成含 0.8% DMSO 的溶液。用 70% 乙醇对预热的细胞复苏培养基管外壁进行消毒，并将 10 mL 培养基转移至一管冷冻报告细胞中以解冻细胞。

关闭报告细胞管，将其置于37摄氏度水浴中5至10分钟。从水浴中取出细胞后，轻轻倒置管子数次以打散细胞团块，形成均匀的细胞悬液，然后用70%乙醇清洁管壁表面。使用多通道移液器将100 µL报告细胞悬液加入96孔板的每个孔中，再将100 µL样品以每组三个复孔的形式加入相应的孔中。

将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育22至24小时。在培养结束前，从冰箱中取出检测试剂和检测缓冲液，放置于避光区域，待其平衡至室温后，轻轻倒置每根试管以混匀溶液。在培养即将完成时，立即将检测缓冲液的全部内容物倒入检测试剂管中，配制成荧光素酶检测试剂。

轻轻混匀管内液体，避免产生气泡。将样本板中的内容物弃入不合适的废液容器中，并轻轻将其在干净的吸水纸上拍打，以去除孔中残留的液滴。每孔加入100 µL荧光素酶检测试剂，将检测板在室温下静置15分钟，然后使用96孔板读板式光度计定量检测发光信号。

对人类饮食中常见的22种水果和蔬菜提取物进行了雌激素类化合物的筛查。雌激素活性以定性等级方式呈现，分为高、中、低或无活性。有机和非有机大豆均显示出高水平的活性，而其他所有水果和蔬菜样品均未检测到活性。

将大豆的检测结果与标准曲线进行比较，同样表明在此浓度下其具有较高的雌激素活性。大豆提取物是已知的强效异黄酮（染料木黄酮和大豆苷元）来源，进一步用于确定产生最大信号50%时所需的稀释倍数。该提取物需要比标准稀释方案多稀释422倍，才能产生一半的信号强度。

具有活性的样品可送交质谱分析，以鉴定其中的活性化学成分。通过使用拮抗剂方法，我们还可以确定植物性食物是否含有减少内源性雌激素结合与活性的化学物质。该技术有助于进一步了解雌激素样食物在灵长类动物饮食中的普遍程度，同时结合粪便激素分析和野外数据，可深入探究摄入植物雌激素对生理和行为的影响。