使用市售试剂盒检测水中内分泌活性 体外 转录激活生物测定

本标准化流程的总体目标是利用市售的基于受体的细胞检测方法，对水样中的内分泌活性化学物质进行筛查。该方法有助于回答水质监测领域中的关键问题，例如，样品中是否确实存在内分泌活性化学物质？该技术的主要优势在于，与当前的化学分析方法相比，能够更快地检测一类内分泌活性化合物。

该技术有助于诊断由内分泌干扰物引起的水质问题。该方法可揭示水中的污染物，也可应用于其他环境基质，如沉积物和组织。通常，初次接触该技术的人员可能会遇到困难，因为其在使用移液技术时需要极高的精确度。

开始此实验步骤时，按照文本方案中的说明，使用特定检测培养基和参比化学物质的储备溶液制备水样。将特定检测培养基于4°C条件下保存，以实现长期储存。接下来，在无菌离心管中，向285微升检测培养基中加入15微升相应的参比化学物质储备液。

用移液器上下吹打混匀样品。然后，向另外八个试管中各加入200微升含5% DMSO的检测培养基。从第一管中转移100微升等分试样至第二管，开始进行三倍梯度稀释。

用移液器将二号管中的稀释样品充分混匀。然后，从二号管中转移100 µL等分试样至三号管。对每支试管重复此操作。

然后，通过将10微升DMSO加入190微升检测培养基中，制备溶剂对照样品。接着，收集并标记四个新离心管。向第一个管中加入95微升检测培养基。

然后，加入5 µL水提取物并充分混匀。向其余三个试管中各加入50 µL含5% DMSO的检测培养基。随后，通过将50 µL溶液从一个试管转移至下一个试管，进行两倍稀释。

从液氮罐中取出一管处于ER或GR分裂阻滞状态的细胞。将细胞管放入37摄氏度水浴中，轻轻振荡两分钟，快速解冻。然后用70%乙醇对细胞管进行去污染处理。

将其置于二级生物安全柜中。采用无菌技术打开小瓶，将细胞转移至10毫升培养基中。在200 × g条件下离心5分钟。

离心完成后，使用无菌玻璃移液管吸除上清液。然后，将细胞沉淀重悬于6 mL的检测培养基中。取5 µL细胞悬液与5 µL活体染色液混合。

然后，取一份等分试样加入计数室中。使用光学显微镜或自动细胞计数器对活细胞数量进行计数。随后，估算细胞悬液中活细胞的密度。

必要时进行稀释，以获得每毫升检测培养基中550,000个活细胞的终浓度。首先设计一个板式布局，包括九点检测特异性校准曲线、质量保证/质量控制（QA/QC）样本，以及每种水提取物的多个稀释度。向无细胞的复孔对照孔中加入90 µL检测培养基。

将细胞悬液倒入无菌的移液槽中。然后，使用多通道移液器向其他孔中加入90 µL细胞悬液。向相应的孔中加入10 µL稀释后的样品。

用盖子盖住培养板，然后将培养板置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中孵育16小时。孵育结束后，让培养板恢复至室温。

随后的步骤应在无直射光条件下进行。根据制造商说明书配制6×上样缓冲液。然后，向每个孔中加入20 µL上样缓冲液。

每孔加入10 µL细胞活力试剂，以评估稀释水提取物的细胞毒性。用铝箔封板膜密封培养板，然后在室温下避光孵育两小时。

孵育完成后，将酶标板放入具备底部读数功能的微孔板读数仪中。按照文本方案中所述方法测定荧光并分析数据。本研究中分析了四个经处理的城市废水排放口的24小时混合样品、六个采自美国南加州淡水系统的地表水瞬时样品，以及一个由超纯水组成的现场空白样品。

在10个代表性水样中，有7个检测到雌激素受体（ER）活性，4个检测到糖皮质激素受体（GR）活性。雌激素受体和糖皮质激素受体检测的质控/质保性能指南可在此处查看。细胞毒性及样品精密度的研究结果均远在可接受标准范围内，证实了水样检测结果的有效性。

在二级出水中检测到最高的生物测定当量浓度，而三级出水的糖皮质激素受体（GR）活性则低于生物测定的检出限。同样，大多数地表水样品未检测到高于检出限的GR活性，其雌激素受体（ER）活性水平也远低于二级出水。大多数污水处理厂出水样品在雌激素受体（ER）和糖皮质激素受体（GR）生物测定中均表现出高于检出限的剂量反应。

此处展示了这些样品的平均蓝色/绿色荧光比值相对于富集因子的代表性结果。如果操作得当，该技术可在 24 小时内完成。在实施过程中，遵循所有质量保证/质量控制（QA/QC）指南至关重要。

该技术为管理者探索水中内分泌干扰物监测的替代方法铺平了道路。请注意，叠氮化钠具有潜在危险性，操作时应采取预防措施，例如在通风良好的通风橱中进行操作。