利用流式细胞术检测和定量发育期斑马鱼中异常的血液形成

本方案具有重要意义，因为它能够在发育中的鱼类中实现基因的敲低和过表达，并对这些操作对血细胞产生的下游效应进行定量分析。该方案快速、操作简便、经济实惠，并且在具备适当仪器设备的情况下易于实现自动化。本次实验操作将由实验室的本科研究人员 Kristen Rueb 演示。

首先，将5至200个受精后48小时的胚胎转移至一个塑料的10厘米培养皿中。倾斜培养皿，使胚胎沉降至底部边缘，并尽可能吸除培养皿中的E3培养基。然后向胚胎中加入500微升去壳蛋白酶（dechorionation protease）。

在室温下放置五分钟后，再次将所有胚胎移至培养皿底部边缘，轻轻敲击培养皿侧面，使胚胎轻柔地与培养皿底部摩擦，以彻底去除其卵膜。使用挤压瓶加入约20毫升E3培养基以稀释蛋白酶，并让胚胎自然沉降。然后倾去培养基，再用新鲜培养基如上所述冲洗胚胎三次，以完全去除残留的蛋白酶。

为准备胚胎的解离，使用P1000移液器将5至10个胚胎转移至一个1.5毫升微量离心管中，并吸除转移的E3培养基。然后向胚胎斑马鱼中加入1毫升含10毫摩尔DTT的E3培养基，将微量离心管置于水平位置，在室温下孵育30分钟，以去除黏液包被。进行胚胎解离时，用每次1毫升含钙和镁的DPBS缓冲液洗涤经DTT处理的胚胎，共洗涤三次。

加入500微升含钙和镁的DPBS以及5微升5毫克/毫升的解离蛋白酶后，将样品在37摄氏度、185转/分钟的水平轨道摇床上孵育60分钟。务必定期检查胚胎，以免消化过度。

当观察到样本不完全均一且含有部分固体组织时，使用 P1000 移液器吹打胚胎，直至样本完全解离。为了将解离的斑马鱼胚胎细胞制备用于流式细胞术，将全部细胞样品转移至带有 35 微米细胞滤网帽的 5 毫升聚苯乙烯圆底管的上层储液室中。用不含钙和镁的 4 毫升 PBS 冲洗滤网帽，并通过离心收集细胞沉淀。

然后每管加入500 µL不含钙和镁的PBS重悬细胞。进行斑马鱼胚胎细胞流式细胞术分析时，在每管中加入1:1000稀释的红色死细胞染料前，轻轻涡旋混匀细胞悬液。加入死细胞染料后30分钟内，清空废液罐，将鞘液罐加满适当溶液，并启动流式细胞仪的流体系统。

在分析软件中绘制五个图，将第一个图设置为测量前向散射与侧向散射。将前向散射设为线性，侧向散射设为对数。将第二个图设置为测量前向散射高度与前向散射宽度，第三个图设置为测量散射高度与侧向散射宽度。

将第四幅图设置为在x轴上测量红色死细胞染料，在y轴上测量侧向散射光，以便区分活细胞与死细胞。第五幅图应设置为检测所选的荧光染料。当所有图均设置完毕后，将样品加载到流式细胞仪上，并降低流速，以防止细胞过快地被耗尽。

调整前向散射和侧向散射参数，使细胞群体的主体部分能够被清晰观察，并在细胞群体周围绘制门控。将此门命名为“cells”。在第二个散点图中，以“cells”门控后的细胞为基础，根据前向散射和侧向散射对单细胞进行门控，以排除双联体。

在第四幅图中，调整红色死细胞染料的设置，使出现明显的阴性细胞群。围绕这些细胞画一个门，并将此门标记为活细胞。在第五幅图中，对活细胞设门，并围绕阳性细胞画门，然后运行每个样本，至少收集 25,000 个活细胞事件。

当所有样品分析完成后，按照关机程序关闭流路系统，重新加满鞘液箱并清空废液箱。在分析每份胚胎斑马鱼样品中GFP阳性红细胞的百分比后，可计算对照组所有样品的平均值。通常将该平均值设为1，所有百分比均基于此参考点进行计算。

在此代表性分析中，确定使用特异性吗啉代降低 ISM1 转录本水平，可减少受精后 48 小时胚胎中表达 GFP 的红细胞数量。通过外源 mRNA 挽救 ISM1 吗啉代导致的表达降低，可使红细胞数量恢复至正常水平。样本的适当消化至关重要。

如果消化过度或消化不足，将无法获得正确的结果。如果有传真机，研究人员可以通过分选血液细胞用于体外培养、RNA测序和定量RT-PCR。