高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微CT分析的切片、取芯及图像处理指南

目前关于用于同步辐射显微计算机断层扫描的骨样本获取的相关数据仍较为匮乏。本综合教程提供了一种简单、微损伤且成本效益高的方法。获取具有统一尺寸和圆柱形形状的骨样本，对于确保所得数据集的高质量以及结果的适用性至关重要。

本文所述技术适用于对岩石、化石或任何硬质材料进行钻孔。我们已利用这些技术采集了尺寸均一的岩石和单晶岩心，用于开展探索地壳和上地幔流变学特性的高压实验。初学者在对骨样进行钻孔时，可能会发现样品形成圆锥形结构。

可以通过留出充足的时间让骨粉从钻头中充分排出，并降低取芯速度来解决这一问题。目前缺乏展示用于同步辐射显微计算机断层扫描及逻辑分析的骨样本采集过程的教学文本和视频。我们提供的分步骨组织制备教程有助于填补这一空白。

将一块 75 × 25 毫米的玻璃载玻片置于加热板上，加热至最高 140 摄氏度，在载玻片中央熔化足量的热固性环氧树脂。将骨块的腹侧压入载玻片上的热固性环氧树脂中，使骨的长轴与载玻片垂直。前后移动样本，以涂覆骨块底面并确保牢固粘附。

将已安装的样品置于加热板上约五分钟，使热固性环氧树脂渗入孔隙和裂纹中，同时确保载玻片上的环氧树脂无气泡。若存在气泡，可前后移动样品以去除。使用钝头镊子将带有样品的载玻片从加热板上取下，在室温下冷却约10分钟，然后用刀片清除载玻片边缘的环氧树脂，以确保样品台能够牢固夹持载玻片。

将带有附着样本的切片固定到玻璃载片夹具上，并将夹具安装到低速切片锯的摆动臂上，调整位置，使骨组织的横截面能够垂直于其长轴被切割。调节摆动臂，确保刀片与样本接触并完全穿过样本。在切割臂的远端添加配重，以平衡臂本身的重量，并向液体储槽中加入蒸馏水和切割液。

牢固固定金刚石晶圆刀片，并确保液位浸没刀片的切割部分。将转速设为 200 RPM，缓慢将样品 lowered 放置到刀片上。一旦锯切开始，需确保刀片和卡盘无晃动或跳动现象。

如果出现上述情况，请立即停止电锯并拧紧锯片或夹头臂组件。如果夹头剧烈上下移动，请增加更多配重。第一个厚段为废料切割，可提供一个与后续每次切割均平行的明确定义的表面。

完成初步废料切割后，抬起旋转臂，使用定位旋钮将卡盘向刀片方向移动五毫米。切片完成后，将带有已安装样品的载玻片置于加热板上，以熔化热固性环氧树脂。使用先前所述的热固性环氧树脂粘接技术，将五毫米骨组织切片固定至浅铝皿底部。

将锡罐放置在铣钻机的XY工作台上，并用手拧紧固定夹具。将内径为2毫米的空心轴珠宝钻头（带金刚石钻头）插入铣钻机的夹头中，并调整深度限位器，以防止钻透锡罐。调整骨样本前部中央位置至钻头正下方，同时避免与骨膜、开口处或高度小梁化的区域发生近距离接触。

将蒸馏水注入锡罐中，直至完全浸没样品，以防止在取芯过程中产生过多热量、样品烧焦以及钻头损坏。使用铣床钻机时若不采取适当的安全措施，可能存在危险。操作人员应确保佩戴护目镜，固定好宽松的衣物，并将长发向后扎起，以防被主轴缠住。

在钻头与骨骼初次接触的前几次操作中，应施加轻柔的压力，以便在骨骼上表面磨出一个环形凹槽。这可以防止取芯过程开始时钻头发生偏移，并确保钻头的准确定位。在取芯过程中，需将钻头在样本中反复提拉，同时保持钻头尖端始终位于水面以下。

每隔几秒执行一次此操作，以冲洗出残留的骨粉，并确保碎屑不会堵塞钻头。取芯完成后，所获得的骨组织可能卡在中空柄钻头内部。使用尖头镊子或小型六角扳手将骨芯从钻头中取出。

将钻取的样品存放在贴有标签的微量离心管中，置于阴凉干燥处，直至成像。所述的钻取取样方法被证明具有高度的有效性和效率。此处展示了使用钻取法获取的样品与使用旋转工具获取的样品在图像处理流程上的代表性对比图。

使用普通旋转工具切割的样本与钻取样本相比，显示出更多的管道和陷窝数量，但平均管道直径、管道体积和皮质孔隙率均有所降低。本表格展示了每个样本的孔隙率数据。尽管钻取方案减少了同步辐射显微计算机断层扫描中观察到的伪影，但来自直线骨块实验的低质量且含有较多伪影的图像反映了一个多方面的复杂问题。

后续的图像处理证实了该技术在改善皮质骨微观结构可视化方面的潜力。例如，可观察到矿化差异、骨单位边界的更清晰界定，以及血管通道内软组织的一致性可视化。操作过程中保持缓慢推进是获得尺寸一致的圆柱形样本的关键。

过快操作可能导致样本呈圆锥形而非圆柱形。在获取用于取芯的厚切片时，可同时收集额外的厚切片用于明场或共聚焦显微镜观察，以实现对小管网络的可视化。