一种高通量的斑马鱼精子冷冻保存方法 体外 受精

大家好，我是来自加利福尼亚大学戴维斯分校分子与细胞生物学系的 Bruce Draper，这位是来自西雅图弗雷德·哈钦森癌症研究中心基础科学分部的 Cecilia Moans。今天，Cecilia 和我将演示斑马鱼精子冷冻保存的实验方案，该方案是在 Brian Harvey 原始方案基础上的改进版本。我们将向您展示，两人一组合作操作，可在两小时内完成多达 100 条雄性斑马鱼的精子冷冻保存。

尽管解冻后的受精率存在较大差异，但平均而言，我们获得的受精率为25%，而这些样本来自一个已冷冻保存超过七年之久的精子库。现在我们开始操作。在进行该操作前，首先配制精子冷冻溶液。

Ginsburg 鱼用林格氏液每三天新鲜配制一次，冷冻保护液则每天新鲜配制，分为含甲醇和不含甲醇两种。这些溶液的成分可在本方案所附的在线补充信息中找到。本实验过程中所使用的材料可能会影响精子冷冻与解冻的速率，进而影响冻存精子的受精能力。

因此，推荐材料清单也作为补充在线信息提供。最好将精子冷冻在细碎的干冰上，而不是干冰颗粒上。一种简单的干冰粉碎方法是用毛巾包裹干冰，然后用锤子将其捣碎。

更高效的方法是使用干冰研磨机，例如 claws 型号 RE2，来冷冻斑马鱼精子。首先，用记号笔在 10 微升毛细管上标记 3.33 微升刻度线，或从管底向上约 16.7 毫米处进行标记。为麻醉雄鱼，将 2 至 4 条雄鱼放入含有三卡因稀释液和养鱼用水的烧杯中。该溶液配方可在《斑马鱼手册》中找到。

麻醉后，使用塑料勺将鱼从麻醉液中取出，并用纸巾轻轻吸干。特别注意吸干腹部区域。水会激活精子，因此彻底擦干生殖孔周围至关重要。

将鱼置于海绵固定架上，腹面朝上。若腹鳍周围区域仍湿润，可用无尘纸轻轻擦干。将带有标记的毛细管插入随毛细管提供的橡胶吸头适配器中。

连接器是一段橡胶软管，一端带有吹嘴，另一端带有毛细管固定装置。或者，也可将毛细管连接至一支50微升的Hamilton注射器。取一段适当直径的特氟龙管，将雄鱼置于显微镜下，轻轻分开其腹鳍以暴露泌尿生殖孔。

使用毛细管末端，用平头镊子轻轻夹压鱼体两侧，或用食指和拇指轻轻挤压鱼体两侧，将精子排出，并通过轻柔的负压吸取方式用毛细管收集排出的精子。注意避免混入可能随精子排出的粪便。目标精子体积为 3.3 µL。

可接受的最低精子量取决于精子的质量。优质精子呈白色且不透明，而劣质精子则呈水样。通常情况下，可接受的最低精子量为一微升优质精子或达到目标量的三分之一，以及两微升劣质精子或达到目标量的三分之二。

如果精子体积未达到目标体积3.3微升，则需使用不含甲醇的冷冻保护液将体积调整至毛细管上的刻度线。如果精子体积已达到或超过毛细管上的刻度线，则进行下一步操作。现在向精子中加入冷冻保护剂。

用甲醇将冷冻介质吸取至橙色标记处，此时总体积约为 20 微升。将精子与冷冻保护剂的混合物轻轻吹打到表面皿的洁净区域，通过上下吹吸约四次使其充分混匀，注意避免产生气泡。

用移液器将10微升精子冷冻保护液分别加入两个已标记的冷冻管底部，将精子等分至这两个冷冻管中。迅速盖紧管盖，立即将每个冷冻管放入各自的15毫升离心管中。在室温下盖紧离心管，并将其插入细粉状干冰中。

插入冻存管时应足够深，仅露出管盖，以便追踪冻存管。对冻存管进行编号，并记录每管放入干冰的时间。让精子在干冰中冷冻20分钟。

精子冷冻后，将两个冻存管转移至装有液氮的杜瓦瓶中，用于临时保存。将冻存盒置于液氮浴中，以防止样品温度升高。

使用长金属镊子从杜瓦瓶中取出冻存管，并戴上低温手套进行操作。或者，可将冻存管直接从干冰转移至超低温冰箱中。若需长期保存，将冻存盒置于泡沫塑料容器内的液氮中，则应将冻存管放入液氮超低温冰箱中。

为了保持精子活性，必须将冻存管浸没在液氮中储存，若将冻存管存放在液氮的气相中，精子活性可能会随时间推移而下降。速度对于维持精子活性同样至关重要。从添加冷冻保护剂到将精子冻存管置于干冰上的时间间隔不应超过30秒。体外受精。

使用冷冻保存的精子进行操作时，最好由两人配合完成。一人从雌性个体中挤出卵子，另一人同时解冻精子。将水浴温度设置为 33 摄氏度。

从液氮冻存罐中取出一个冻存管，并转移至装有液氮的杜瓦瓶或烧瓶中，待解冻前保存于此。将麻醉雌鱼的卵子挤入一个35毫米的塑料培养皿中。此操作在JoVE实验方案《通过早期压力制备雌核发育斑马鱼》中有详细描述，该方案对斑马鱼的操作提供了详尽说明。

体外受精时，优质的卵团应包含超过150个均匀且呈淡黄色的卵。任何白色碎屑均提示卵子发生退化。如有可能，尽量获取三个卵团，并将其合并至一个培养皿中。

如果在第一次产卵后一分钟内未获得三个良好的产卵，则进入下一步操作。在精子解冻过程中，保持培养皿加盖。同时，从液氮中取出冻存管并拧开管盖。

将小瓶迅速浸入33度水浴中约一半深度，持续8到10秒。迅速向小瓶中加入70 µL室温的Hank's平衡盐溶液，立即用移液器上下吹打混匀，随后加入培养皿中的卵子中，并用移液器头轻轻混匀。然后立即加入750 µL鱼用水，涡旋混匀以激活精子和卵子，在室温下孵育5分钟。

五分钟后，将鱼和水加入培养皿中，在28摄氏度条件下孵育。两到三小时后，统计并转移存活的胚胎至100毫米的培养皿中，每皿50个胚胎。同时统计受精卵数量，以确定精子样品的受精率。

精子受精率是指可发育为存活胚胎的卵子数量与体外受精所用总卵子数的比值。卵子可在体外受精后2至6小时内的任意时间进行分选。当不具受精能力的卵子与存活胚胎易于区分时，不具受精能力的卵子表现为透明且未发生分裂。

在体视显微镜下使用透射照明观察时，冷冻保存精子的平均受精率差异较大。然而，通常可以获得约25%的平均受精率，且该水平可稳定维持多年。本图显示了2001年至2003年期间冷冻的精子在直至2008年的检测中所获得的平均受精率百分比。

我们刚刚展示了一种高通量冷冻保存斑马鱼精子的方法。在进行该实验方案时，重要的是使用所有推荐的塑料耗材和设备，并使用研磨粉碎的干冰，而不是干冰颗粒。必须使用质量极高的精子和卵子；在体外受精过程中，当使用精子时，应尽可能使用大量的卵子，以提高最终获得的可育胚胎数量，这可能需要三到四条雌鱼。

该方案的另一个关键因素是速度。从雄性个体中取出精子到将其放入干冰的整个过程，应始终控制在大约一分钟之内。好了，我认为就这些了。

祝您的实验顺利。