使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激

因此，TBARS 检测法最适合用于实验室内部对生物样本氧化应激水平进行一般性评估，其中直接比较的是经相同储存和处理条件下的样本之间的相对 TBARS 水平。该检测方法的成本极低，检测 96 个样本约需 3 美元，而商业试剂盒的成本约为 400 美元，且仅允许分析单一批次的样本。本文所述方法可进一步适用于特定应用，包括生物样本稳定性研究，以及在分析前需添加抗氧化剂或其他类型样本保护剂的研究。

为避免结果出现高度变异，需配制新鲜试剂，并确保显色试剂的 pH 值不超过 4，在测定吸光度前去除微孔板中的气泡。首先配制 0.8% 的硫代巴比妥酸水溶液。通过将 4 克氢氧化钠颗粒溶解于 20 毫升水中，配制 5 摩尔的氢氧化钠溶液。

将溶液储存于塑料容器中。每次使用时应 freshly prepared（新鲜配制）。将四克硫代巴比妥酸加入450毫升去离子水中，并使用磁力搅拌子轻轻溶解。

以每100微升为增量，缓慢加入约四毫升氢氧化钠溶液，同时监测pH值，直至硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。持续添加氢氧化钠溶液，直至所有颗粒完全溶解。使用pH试纸确认溶液的pH值不超过4，然后用去离子水定容至500毫升，并将硫代巴比妥酸水溶液于室温下保存。

在2毫升带盖聚丙烯管中配制丙二醛双甲缩醛标准曲线溶液。按照文本稿件中的描述，用水稀释200微摩尔的储备液。涡旋混匀样品。

标记待分析样品的玻璃管，然后向每根管中加入100 µL制备好的样品。向每个样品中加入200 µL 8.1% SDS，轻轻旋转混匀玻璃管。向每个样品中加入1.5 mL 3.5 mol/L醋酸钠缓冲液，然后加入1.5 mL 0.8%硫代巴比妥酸水溶液。

通过加入700微升去离子水，将各管中的终体积调至4毫升。盖紧玻璃试管，置于设定为95°C的加热块中孵育1小时。用铝箔纸覆盖试管以防止冷凝，然后将试管从加热块中取出，置于冰上孵育30分钟。

孵育结束后，在4°C条件下，以1,500 × g离心10分钟。用移液器从每根离心管中转移150 µL上清液至96孔板的孔中，并用移液器吸头去除任何气泡。在532 nm波长下测定各样品的吸光度，然后从所有其他样品的吸光度读数中减去空白样品的平均吸光度值。

创建标准曲线并利用其计算未知样品的浓度。通过生成丙二醛双二甲基丙酮（MDA bis dimethyl acetol）标准曲线，以确定该检测方法的检出限、灵敏度以及三种不同生物样品中的氧化水平。在不同日期对这三个样品共进行了9次TBARS检测。

为确定检测限，需在三个不同的日期测定空白样品的吸光度。产生可检测的非噪声吸光信号所需的TBARS物质最低浓度为1.1微摩尔。该检测方法的灵敏度约为每微摩尔浓度增加0.0016吸光度单位。

TBARS 检测可用于检测各种生物基质中脂质过氧化的变化。为了验证这一点，使用氯化铜（copper two chloride）在体外诱导人血清、HEPG2 细胞裂解物和低密度脂蛋白（LDL）的氧化。对含有 EDTA 的 LDL 样品进行 TBARS 检测，结果显示，经氯化铜处理与未处理的 LDL 样品之间的 TBARS 水平无显著变化。

然而，在通过离心过滤去除EDTA后，LDL发生了铜离子介导的氧化。为了说明TBARS检测法在人血清中的动态范围，向样品中加入了2毫摩尔的铜离子，结果TBARS值升高了6至7倍。在进行该实验方案时，样品在冰上放置的时间不得超过10分钟，离心后应置于室温下。

对于那些最初未同时采集、处理和储存的生物样本批次或子集，应通过统计学方法评估数据中是否存在批次效应，以确保人为氧化未对结果产生影响。对低密度脂蛋白进行可控的体外氧化定量，有助于理解氧化如何影响其生物学功能。