通过异源细胞系统中蛋白质聚集测量跨细胞相互作用
2020年5月22日
本文介绍了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜在异源细胞系统中快速、半定量地检测反式配体-受体相互作用。
基于细胞的检测方法可实现对跨细胞黏附相互作用的观察与定量，无需进行耗时的蛋白质纯化或使用特殊设备。尽管此处检测的蛋白质相互作用与神经生物学相关，但该方法也可应用于任何涉及细胞间蛋白质黏附的研究领域。转染 HEK-293T 细胞 48 小时后，从六孔板中收集细胞用于聚集体实验。
首先，用 PBS 每孔洗涤两次。接着，加入 1 毫升 10 毫摩尔 EDTA 至每孔，以轻柔地解离细胞，然后将培养板置于 37 摄氏度孵育。孵育 5 分钟后，轻轻敲击培养板使细胞脱落，并将每孔的细胞收集至各自的 15 毫升锥形管中。
在室温下以 500 × g 离心试管 5 分钟。在细胞沉淀期间，通过在微量离心管管盖上标记实验条件，准备六个孵育管。应使用 GFP 和 mCherry 的每一种组合。
从15毫升锥形管中移除上清液，并将细胞重悬于500微升培养基中。使用血细胞计数板对每个锥形管中的细胞进行计数。然后从每种条件下取200,000个细胞，加入相应的孵育管中，总体积为500微升，进行一对一混合。
在评估下一节所述的基线聚集情况后，将孵育管置于室温下的慢速管旋转仪中。为评估聚集情况，分别在基线时间点以及60分钟后，从孵育管中吸取40微升液体至带电荷的显微镜载玻片上。在将细胞加入微量离心管后，应尽快完成基线数据的采集。
在荧光显微镜下，使用绿色和红色通道对载玻片进行成像。每张载玻片需在同一焦平面上采集三个不同视野的图像。HEK-293T细胞被转染了目的蛋白、突变的目的蛋白或目的配体，并共转染了荧光蛋白。
表达目标蛋白的细胞群体与表达目标配体的细胞群体混合后，在60分钟时评估其聚集情况。在绿色和红色通道图像的叠加图中，聚集表现为黄色斑点。未表达任何突触配体的细胞组别中，聚集现象极少。
此外，当仅有两个细胞群中的一个表达突触配体时，仅表现出轻微的聚集。当两个细胞群表达不相容的黏附分子时，则未表现出聚集。在表达相容性黏附分子的条件下，经过60分钟孵育后表现出显著的聚集。
令人意外的是，该突变目的蛋白的聚集程度显著高于其野生型对应物，表明该点突变增强了蛋白质的结合能力。许多黏附分子的突变通常与神经发育障碍、神经精神疾病及成瘾性疾病相关。利用该技术，可筛选与疾病相关的点突变对跨分子相互作用的影响。
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概述
本研究提出了一种优化的实验方案，利用荧光显微镜技术在HEK-293T细胞中快速、半定量地测量反式配体-受体相互作用。该方法可用于量化与神经生物学及其他潜在研究领域相关的蛋白质黏附相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经生物学
- 细胞黏附
- 蛋白质相互作用
背景
- 配体-受体相互作用对细胞间通讯至关重要。
- 理解这些相互作用有助于阐明神经发育和神经精神障碍的机制。
- 传统方法可能需要大量的蛋白质纯化或专用设备。
- 本研究提出了一种利用荧光显微镜的更高效方法。
研究目的
- 建立一种快速有效的基于细胞的检测方法，用于研究蛋白质黏附。
- 评估蛋白质中单点突变如何影响反式相互作用。
- 将该方法广泛应用于神经生物学以外领域的蛋白质黏附研究。
使用的方法
- 采用荧光显微镜对细胞相互作用进行成像。
- 以 HEK-293T 细胞作为生物模型，重点研究转染的蛋白质和配体。
- 实验时间线包括转染后 60 分钟进行细胞聚集情况的评估。
- 使用血细胞计数板进行细胞计数，随后将细胞重悬并混合用于成像。
主要结果
- 表达相容性黏附分子的细胞在60分钟后聚集显著增强。
- 与野生型蛋白相比，突变蛋白表现出更强的聚集性，表明其结合能力有所提高。
- 当仅有一个或没有细胞群表达突触配体时，观察到的聚集现象极少。
结论
- 本研究展示了一种评估细胞间黏附相互作用的简化方法。
- 研究结果强调了该技术在探索突变对蛋白质相互作用影响方面的潜力。
- 该方法所提供的见解对于理解多种神经发育和心理障碍相关机制具有重要价值。
常见问题
行业重要性概要
该检测方法能够在细胞环境中直接测量反式蛋白质-蛋白质相互作用，解决了生化检测无法区分顺式与反式结合的关键局限性。通过仅定量生理相关的细胞间黏附，该方法提高了靶点验证的可信度，并减少了早期发现中的假阳性结果。该方法支持对参与神经发育和神经精神障碍的黏附靶点进行机制层面的风险评估。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过测量表达于不同细胞上的配体与受体对之间的功能性反式黏附，验证治疗假设。
- 操作价值：无需蛋白质纯化，可在细胞系统中直接快速筛选突变体或变异体。
- 预测价值：与疾病相关的突变导致聚集增强，表明该检测可用于识别并优先筛选获得功能的变异体。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪性： 使用荧光标记的 HEK 细胞生成可量化的成像读数（例如，叠加图像中的黄色斑点），适用于高内涵筛选的适应性检测。
- 可重复性： 标准化的细胞混合与孵育条件，可在不同实验间实现一致的聚集测量结果。
- 可扩展性： 该方案支持通过简单的混合与成像步骤，平行测试多种条件（例如，野生型 vs. 突变型、配体组合）。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：直接检测黏附分子中的点突变（在神经发育、神经精神及成瘾性疾病中常见）如何影响跨细胞相互作用。
- 转化连续性：将体外结合实验与细胞表型相联系，基于功能性黏附数据支持可行或终止决策。
- 机制风险降低：确定突变是增强还是破坏细胞间结合，从而为靶点机制和安全性分析提供依据。
流程与工作流整合
该检测介于靶点结合筛选与功能验证之间，可提供特异性的黏附数据，用于指导先导化合物优化和临床前候选物筛选。
- 发现生物学：检测基因变异是否改变细胞间黏附，从而支持通路解析和靶点假设验证。
- 分析技术：生成基于定量成像的读数（随时间变化的聚集体形成），用于比较不同条件并评估相互作用强度。
- 转化研究：将分子变化与突触形成及神经元连接相关的细胞表型关联起来。
- 企业级复用：可适用于任何细胞间蛋白质黏附系统，使其成为跨治疗领域的可重复使用平台。
运营与企业影响
- 科学价值：仅检测反式相互作用，减少了基于裂解液的检测中常见的结合过度估计问题，提高了靶点特异性。
- 操作价值：使用标准的细胞培养和荧光显微镜技术，无需特殊设备或复杂试剂。
- 战略价值：能够快速评估突变对靶点功能的影响，支持在先导化合物识别中做出更优的“进行/不进行”决策。
- 项目组合影响：通过识别黏附特性发生改变的变异体（可能影响药效或毒性），支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备哺乳动物细胞转染、荧光蛋白标记以及基于流式细胞术或血细胞计数板的细胞计数技术的专业知识。
- 依赖具备双通道成像功能（例如 GFP 和 mCherry）的荧光显微镜及用于聚集体定量的图像分析工具。
- 需要对细胞表达水平和混合比例进行标准化，以确保不同团队间聚集体检测结果的可重复性。
- 应用于非 HEK 细胞体系时，可能需要优化转染效率和黏附分子在细胞表面的表达。
- 仅限于评估黏附行为，无法报告结合后发生的下游信号传导或内化事件。
