监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

到目前为止，蛋白质聚集的机制主要在体外进行研究。通过我们的实验方案，可以在模式生物秀丽隐杆线虫（C.elegans）中开展类似的定量研究。本方法的主要优势在于能够无偏倚地定量包涵体数量。

通过将这些高质量数据拟合到数学模型中，我们可以深入了解聚集机制。蛋白质聚集发生在多种疾病中，包括阿尔茨海默病和亨廷顿病。理解体内蛋白质聚集的分子机制对于开发新的治疗方法至关重要。

首先，使用铂金线虫挑取工具将10条成年线虫转移至一个6 cm涂有菌的NGM平板上，以进行同步产卵。让成虫在20°C下产卵约两小时，随后将其从平板上移除。将含有卵的平板置于20°C培养箱中孵育。持续观察线虫的发育情况，直至其在产卵后约第三天发育至成虫阶段。

通过在所需数量的孔中加入 100 µL M9 缓冲液（补充 25 mM 叠氮化钠作为麻醉剂）来准备 384 孔板。每种菌株各使用一个孔进行成像。对于每种菌株，使用铂金线虫挑取器将 20 条动物转移至一个孔中。

用盖子盖住培养板以防止蒸发，并在制备后一小时内对培养板进行成像。打开仪器并启动软件。点击“卸载培养板”旁边的播放按钮，将384孔板放入显微镜中。

在“操作列表”和“3D荧光采集”下，点击“测试”，并选择含有线虫的孔。将图像处理设置为“无”，然后点击“播放”按钮，以确定使线虫正确居中的最佳位移距离。

将Z轴堆栈的上升距离设为50 m，下降距离设为50 m，切片间隔设为2 m，以捕获动物整体厚度。将图像处理设置恢复为最大值。在孔板扫描设置下选择需要成像的孔。

然后选择“平铺”并采集整孔图像。保存测量设置，点击“开始测量”以启动实验。

打开 CellProfiler，将流程文件拖入“在此处放置流程文件”窗口。单击“是”以加载项目。接下来，将拼接好的图像拖入“在此处放置文件和文件夹”窗口。

单击“元数据输入”模块。根据拼接图像的文件名调整正则表达式，以从文件名中提取信息。单击“名称和类型”输入模块，并调整“选择规则条件”，使其与文件名中的通道匹配。

然后，单击输出设置以选择用于保存 CellProfiler 输出结果的文件夹。单击启动测试模式，使用第一组成像数据集来检查流程的设置。单击逐步运行，一次运行一个模块，逐步执行整个流程。

要调整线虫轮廓，请在 EditObjectsManually 模块中点击“显示帮助”以查看说明。修正轮廓后，点击“完成”以继续运行流程。

单击“退出测试模式并分析图像”。打开输出文件夹以查看输出文件。然后打开图像文件，文件名为原始文件名后跟“outlines”（轮廓），以检查线虫和包涵体是否被正确叠加。

要开始使用 AmyloFit，请为项目命名，然后点击“创建项目”。点击“打开”以启动项目。通过输入会话名称并点击“创建并加载会话”来创建一个会话。

单击“添加数据”，然后按照左侧面板中显示的数据格式要求，上传包含每只动物包涵体平均数量的文件。接着，单击“加载新数据”。将“用于零点偏移的平均点数”设置为 0，并将“用于平台期的平均点数”设置为 0，以跳过预处理步骤，因为包涵体计数数据无需这些步骤。

然后，点击提交。对每种蛋白质浓度重复此步骤。在模型面板中选择自定义。

在“方程”框中输入独立成核的方程，然后点击“加载模型”。对于 Ncells，将参数类型设置为全局常数，并将数值设为 95，对应于体壁肌细胞的数量。

将 Kcell 和 n 的参数类型设置为“全局拟合”，将 m 的参数类型设置为“常数”。在左侧面板中输入不同菌株的 m 值。

保持盆地跳跃次数不变，点击“拟合”面板中的“拟合”按钮。最后，通过点击“下载数据和拟合结果”来提取拟合结果。通过表达不同Q40浓度的四种秀丽隐杆线虫（C. elegans）品系监测了包涵体数量。

独立成核模型能够很好地描述聚集动力学。拟合结果得到反应级数为2.1，核化速率为每细胞每天0.38个分子，对应胞内蛋白浓度为1 mM。先前研究中的两次独立生物学重复实验显示出与反应级数和核化速率高度一致的数值。

需要注意的一点是，为了获得可靠的拟合结果，必须使用多种蛋白质浓度下的高质量数据集。该方法可用于寻找干扰生物体内蛋白质聚集的途径，例如基因敲低或小分子处理。