一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

高级别胶质瘤（如弥散性内生性脑桥胶质瘤）具有高度侵袭性，致死率高。尽管经过多年的广泛研究，血脑屏障仍然是一个重要难题，因为化疗药物难以有效到达脑组织。幸运的是，聚焦超声能够暂时且局部地打开血脑屏障，从而实现有效的治疗。

我们开发了一种小型且经济高效的神经导航聚焦超声系统，用于血脑屏障的开放。该系统采用 commercially available 组件构建，具有高度自动化，可用于临床前药物评价研究。精准医疗的定义是：在正确的时间为正确的患者提供正确剂量的正确药物。

为此，需要筛选大量预先选定的药物。我们紧凑型高通量聚焦超声系统可用于血脑屏障开放，正是实现这一目标的有效工具。本次实验操作将由我研究团队的两名博士生 Rianne Haumann 和 Elvin t Hart 进行演示。

图像引导的立体定向神经导航聚焦超声的工作流程包括在超声平台上进行介入成像和声学耦合，以实现声孔效应。之后，可进行随访成像。根据所设计实验的要求，选择合适的换能器。

将其置于一个装有脱气水的3D打印锥形容器中，容器底部由声学透明的Mylar膜封闭。将换能器连接至函数发生器和功率放大器。将换能器安装在电动线性位移平台上，以实现自动垂直定位，并将其连接至功率放大器。

使用可拆卸的立体定位平台，该平台包含温度可控的加热装置、门齿固定杆和耳杆、麻醉系统以及多模态定位标记物。将该平台连接至二维线性移动平台。在使用FUS系统之前，需对其进行校准，并确定换能器的焦点位置。

焦点位置对应于动物在立体定位平台上的垂直位置。动物到达后，需在实验环境中适应至少一周，并定期称重。实验当天，在聚焦超声（FUS）处理前30分钟，通过皮下注射给予布托啡诺。

麻醉小鼠后，涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。如有必要，使用剃刀和脱毛膏去除动物头部的毛发。用水清洗皮肤，以去除任何残留物。

对于使用BLI肿瘤模型的实验，用29号胰岛素注射器腹腔内注射150微升D-荧光素酶底物。为进行微泡给药以开放血脑屏障，插入26至30号尾静脉导管，并用少量肝素溶液冲洗静脉。使用组织胶带固定导管，防止其脱落。

如果插管成功，用肝素溶液填充导管以防止血液凝固。将动物置于温度可控的立体定位平台上，以避免低体温。使用咬合杆和耳杆固定动物头部，并用胶带将尾巴和导管固定在平台上。

用绑带固定小鼠的躯体。将固定好小鼠的立体定位平台置于成像设备中，对动物进行成像。确定动物是否在平台上正确放置。

根据换能器的焦点位置，结合多模态定位标记和图像处理流程来标记动物的位置。通过在获取的X射线图像上叠加脑轮廓，或利用生物发光成像（BLI）图像确定肿瘤中心，以确定靶区。在放置换能器之前，用胶带覆盖动物的鼻孔和口腔，以防止超声耦合剂干扰呼吸。

在小鼠头部涂抹超声耦合剂，以确保声波的良好传导。将针式水听器置于枕骨附近，记录微泡空化信号。根据校准值，引导换能器至动物体上方的正确位置。

应用预设参数至所有连接的设备，以靶向目标脑区。将换能器置于正确位置后，按照制造商说明溶解并激活微泡。在注射微泡前，用生理盐水冲洗尾静脉导管，以确认尾静脉通路通畅。

启动超声辐照轨迹，同时注射微泡。此时，针式水听器将实时检测并验证微泡空化效应。如需要，可在声穿孔后给予血管内对比剂或药物。

持续监测动物直至预定时间点。当机械指数（MI）为0.4并结合微泡使用时，声压可实现稳定空化效应的高灵敏度和可靠检测；相比之下，未注射微泡时无法检测到次谐波信号，而在MI为0.6时则观察到惯性空化现象。尽管MI高达0.6的声压未引起肉眼可见的组织损伤，但在MI为0.6时，组织学检查已可观察到显微镜下的组织损伤。

压力振幅为机械指数（MI）0.8时，导致较大血管出现肉眼可见的脑出血以及广泛组织溶解，并伴有红细胞外渗。通过静脉注射伊文思蓝以验证脑桥区域血脑屏障（BBB）的开放。在接受聚焦超声（FUS）联合微泡处理的小鼠中，观察到伊文思蓝偶联白蛋白在脑桥和小脑水平外渗，表明对目标区域实现了精确定位。

本方案最关键的步骤包括尾静脉导管的正确放置、动物的定位与靶向，以及结合空化检测的微泡注射与聚焦超声操作。该自制的聚焦超声系统可根据多种研究问题进行调整和重新设计，同时具备成本效益高和工作流程自动化的特点，适合经验相对不足的研究人员使用。