髂内动脉注射法用于高效选择性建立微小骨转移模型
2016年9月26日
本文提供了经髂内动脉（IIA）注射的详细操作步骤，该技术可将癌细胞特异性地递送至后肢组织（包括骨骼），以建立实验性骨转移模型。尽管该方法最初是针对乳腺肿瘤模型建立的，但本方案可轻松扩展应用于其他类型的癌症。
本实验的总体目标是通过髂动脉内注射，将癌细胞直接递送至后肢组织（包括骨骼），从而建立实验性骨转移模型。因此，该方法有助于我们回答有关乳腺癌骨定植的关键问题，尤其是在该过程的早期阶段，乳腺癌细胞如何与骨微环境中的细胞相互作用。今天我们进行了髂动脉注射。
该技术的主要优势在于，它能够高效且选择性地为多种癌症类型建立实验性显微骨转移模型，同时不会造成局部组织损伤。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为在显微镜下准确定位髂动脉注射位置需要一定练习，才能使注射成功率超过百分之九十。首先通过夹捏五至六周龄、体重二十克小鼠的脚趾来确认其镇静程度是否合适。
涂抹眼药膏后，用依次更换的无菌70%异丙醇浸湿的棉签反复擦拭剃毛的右侧腹股沟区域，随后进行碘伏外科擦洗。接下来，用无菌手术巾覆盖小鼠全身。然后，使用无菌的10号碳钢手术刀片和3号刀柄，在右下腹部第四与第五乳头之间的区域做1至1.2厘米的皮肤切口。
将动物转移至标准的台式解剖显微镜下。在4倍物镜下，将钝性分离镊插入脂肪组织与腹膜之间的切口，向两侧推开组织，以暴露髂血管和神经。接着，使用直的精细镊子刺穿血管与邻近血管的神经之间的结缔组织。
然后，将斜角镊子穿过结缔组织并置于髂血管下方，同时将直镊子插入血管另一侧的结缔组织中，以引导斜角镊子穿过组织。我们建议在此步骤中将髂骨边缘和动脉作为一束整体分离并提起。尽管肿瘤细胞仅注射入动脉，但将两条血管一并分离可节省时间和操作难度。
当斜角镊放置到位后，进一步将髂静脉和髂动脉与周围组织分离，并在解剖过程中使血管保持在斜角镊的上方。当血管清晰暴露后，使用直镊将一根4-0丝线缝合线的线端送至斜角镊处，并缓慢轻柔地将缝线从血管下方穿过。此时，髂总静脉和髂总动脉应均由该缝线提起固定。
当血管准备就绪后，将肿瘤细胞上下吹打数次，以重悬为单细胞溶液并分散任何细胞团块。然后，用31号胰岛素注射器每只小鼠吸取100 µL细胞悬液。接着，以缝线为引导，将倾斜的镊子重新滑入血管下方，并打开镊子，使血管轻轻置于镊尖上。
另一只手将针尖斜面朝上插入镊子尖端之间动脉管腔内。缓慢推动针栓注入细胞，细胞悬液将推动血液流经血管。
当所有细胞输送完毕后，轻轻拔出针头，同时用镊子夹住血管使其保持抬高，以防止出血。然后，移除缝线。最后，迅速取下镊子，并用棉签按压切口处 5 至 10 分钟，以止住出血。
在此，展示了经髂内动脉注射5 × 10⁵个GFP荧光素酶标记的MCF-7乳腺癌细胞后，再通过眶后静脉窦注射D-荧光素酶底物，获得的代表性整体动物生物发光图像。注射后第14天，从注射侧髂内动脉供血的后肢骨组织中检测到强烈的生物发光信号，而对侧对照骨组织中未见信号，证实了注射细胞的特异性定位。对荷瘤骨组织进行切片并行苏木精-伊红（H&E）染色，结果显示致密的、鹅卵石样细胞群，细胞核较大，提示在髂内动脉注射后14天，骨组织中已形成显微镜下可见的MCF-7转移病灶。
此外，对骨组织切片进行免疫荧光染色也显示出 MCF-7 细胞与成骨细胞及前成骨细胞相互混杂。一旦掌握，该技术可在十到十五分钟内完成。在完成这些操作步骤后，可采用其他方法回答更多科学问题。
例如，我们可以利用RNA-Seq技术对转移微环境中的细胞进行分析，并将其与正常细胞进行比较。该技术为乳腺癌和前列腺癌研究人员提供了一种在动物体内研究骨微转移的方法。观看本视频后，您应能够充分掌握通过髂内动脉注射建立乳腺癌骨转移模型的操作方法。
请采取适当的预防措施，因为使用氯胺酮和赛拉嗪可能存在极高风险。
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概述
本文详细介绍了通过髂内动脉（IIA）注射将癌细胞递送至后肢组织（包括骨骼）以建立实验性骨转移的方法。该方法对于研究乳腺癌细胞与骨微环境之间的相互作用特别有用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 实验技术
背景
- 骨转移是癌症患者常见的并发症。
- 了解癌细胞在骨组织中定植的机制对于开发治疗方法至关重要。
- 髂内动脉注射法可实现癌细胞的靶向递送。
- 与其它方法相比，该技术可最大限度减少局部组织损伤。
研究目的
- 建立用于研究骨转移的模型。
- 探究乳腺癌细胞与骨微环境细胞之间的相互作用。
- 提高注射技术的准确性和成功率。
使用的方法
- 经髂内动脉注射癌细胞。
- 使用五至六周龄的小鼠模型。
- 通过脚趾夹捏反应监测镇静水平。
- 练习注射技术以达到高成功率。
主要结果
- 该技术可有效建立骨转移模型。
- 经过练习可达到较高的成功率。
- 该方法观察到的局部组织损伤极小。
- 可获得乳腺癌细胞定植早期阶段的深入认识。
结论
- 髂内动脉注射是癌症研究中的一种重要工具。
- 该方法可适用于乳腺癌以外的多种癌症类型。
- 进一步的研究可加深对癌症与骨骼相互作用的理解。
常见问题
行业重要性概述
建立可靠的早期骨转移模型在肿瘤药物研发中仍是一项关键挑战，尤其是在评估靶向微转移定植的治疗干预措施方面。髂内动脉注射技术可实现癌细胞向后肢骨骼的时空同步播散，支持对播散性肿瘤细胞进行可靠定量，同时减少因操作导致的组织损伤所引发的混杂炎症反应。该方法通过允许对惰性骨病变进行连续监测，且不出现全身器官转移，提高了临床前研究的预测可信度，从而增强了骨转移模型在靶点验证和先导化合物筛选中的转化相关性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过模拟癌细胞与骨微环境组分（如成骨细胞和前成骨细胞）的早期相互作用，能够验证治疗假说。
- 操作价值：提供一种选择性强且高效的途径，将癌细胞递送至后肢骨，有助于在不同实验队列中稳定构建模型。
- 战略价值：通过生物发光和组织学检测手段，可视化单个细胞发展为多细胞病灶的微转移过程，从而支持对骨转移通路的机制性风险评估。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可量化的输出结果，如生物发光信号强度和组织学病灶密度，从而实现对转移负荷的标准化评估。
- 操作价值：避免局部组织损伤及相关的伤口愈合干扰因素，提高检测的可重复性，并减少后续分析中的变异。
- 战略价值：产生疾病相关性高且脱靶器官转移极少的模型系统，可在筛选研究中实现对剂量-反应关系和时间效应的长期观察。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过捕捉播散性肿瘤细胞在骨骼中发展为微转移灶的进程，与疾病相关的系统相契合，解决了临床中的一个关键瓶颈问题。
- 操作价值：支持长期活体成像以及终点分析（如苏木精-伊红染色和免疫荧光染色），实现了从发现到临床前验证的连续性研究。
- 战略价值：通过提供针对干扰癌细胞与基质细胞共存或骨微环境中生态位形成的化合物的早期疗效信号，指导基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
髂内动脉注射方法适用于从靶点验证到先导化合物筛选，再到临床前药效测试的整个发现过程，尤其适用于骨靶向治疗药物的研究，其中早期转移模型有助于阐明作用机制和治疗窗口。
- 发现生物学：通过将肿瘤细胞靶向递送至骨骼特定部位，实现对癌细胞与骨微环境相互作用的假设验证。
- 筛选：提供适用于高内涵筛选平台的即用型生物系统，具备定量的生物发光和组织病理学检测读数。
- 分析：生成可量化的因变量，包括生物发光的光子通量、组织切片中的病灶面积，以及肿瘤细胞与基质细胞的共定位指数。
- 转化研究：通过模拟临床骨转移中溶骨性或成骨性进展之前的无血管微转移阶段，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为一种标准化的手术技术，可适用于多种癌症类型和不同实验室，促进骨转移模型构建在跨项目间的一致性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过减少操作引起的炎症干扰，并明确将表型变化归因于药物作用机制，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：利用明确的解剖标志和缝合引导的血管分离，增强实验的标准化与可重复性，最大限度降低操作者依赖的变异性。
- 战略价值：提供早期、器官特异性的转移读数，及早发现未预期的骨趋向性，从而减少后期失败风险，提升“继续/终止”决策效率。
- 组合影响：在同源或异种移植模型中，通过直接比较不同治疗组间的转移负荷，促进骨靶向候选药物的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要熟练掌握显微外科技术，包括在解剖显微镜下进行血管分离和缝合结扎。
- 依赖于无菌解剖显微镜、精细镊子、胰岛素注射器以及等渗细胞悬液制备设备的可及性。
- 需要跨团队统一麻醉方案（如氯胺酮/赛拉嗪）和术后监测流程，以确保动物福利和模型的一致性。
- 适应性考虑因素包括根据癌细胞系的侵袭性和小鼠品系的变异性调整注射体积和细胞浓度。
- 实际限制包括达到超过90%注射成功率所需的学习曲线，以及在腹股沟切口过程中需采用无菌技术以防止腹膜污染。
