利用聚焦扫描超声将抗体递送至大脑

只有少量治疗性抗体能够被大脑吸收。通过我们的方法，可暂时性开放血脑屏障，从而将抗体递送至大脑。该技术使我们能够以非侵入性的方式将抗体递送至小鼠大脑。

使用细胞计数仪对微泡进行质量控制时，从混悬液振荡器中取出微泡溶液，并用19号针头刺穿微泡溶液小瓶的隔膜。使用配备19号针头的1毫升注射器，将100微升微泡稀释于5毫升过滤后的流动溶液中，再用移液器将100微升稀释后的微泡溶液加入含有10毫升过滤流动溶液的比色皿中。将比色皿固定在细胞计数仪的样品台上，并确保样品检测时使用30微米孔径的检测孔。

在软件中加载标准操作方法，选择编辑标准操作方法和浓度。输入稀释倍数为5,000倍，然后点击应用和确定。点击编辑信息以选择合适的文件名。选择预览，并确认微气泡样品浓度低于10%。选择开始和确定，以开始样品采集。

测量完成后，用过滤后的流动液冲洗细胞计数器的孔口。将稀释后的微泡溶液小瓶置于水浴中超声处理30秒。按照演示方法测量经超声处理的微泡溶液，并点击“编辑信息”以将该数据标记为空白样。

测量空白样品后，用初始读数减去最终读数，以排除非微气泡的颗粒。为使用荧光标记的抗小鼠 IgG 抗体对切片进行标记，按照制造商说明书，在室温下将 1 毫克小鼠 IgG 抗体与 Alexa Fluor 647 在 0.1 摩尔碳酸氢钠缓冲液中反应 15 分钟进行标记。孵育结束后，将荧光标记的抗体溶液加载至离心柱中，通过离心纯化抗体。

然后使用分光光度计测量蛋白质浓度。设置聚焦扫描超声系统时，在水囊中预留5毫米空间，以使超声焦点位于水囊底部下方9毫米处。向水囊中加入约300毫升脱气去离子水，并将环形阵列放入注满水的水囊中。

使用牙科镜检查表面是否存在气泡，然后启动应用程序软件。在波形菜单中，选择设置波形占空比，将脉冲重复频率设为 10 赫兹，占空比设为 10%，焦距设为 80 毫米，中心频率设为 1 兆赫兹，振幅设为 0.65 兆帕，机械指数设为 0.65。按下“设置”以定义波形，并将该波形存储在内存中。

选择治疗方案后，在运动控制器窗口中打开扫描选项卡，输入X方向运动的起始、停止和增量值，以及Y方向运动的起始、停止和增量值。为定义治疗位点的操作，请点击事件并打开脚本编辑窗口。选择将在每个治疗位点按所选顺序执行的操作列表，并将运动类型设置为光栅网格。

在事件选项卡中，选择添加动作，并将“同步移动”、“启动 ARB 触发器”、“等待”和“停止 ARB 触发器”动作移至脚本面板。然后点击等待动作，设置等待时间为 6,000 毫秒。为准备动物进行分析，在确认麻醉小鼠对脚趾夹捏无反应后，使用永久性标记笔标记头部中心位置，然后将塑料膜用胶粘在已剪去底部的小型称量皿底部，并在称量皿中填充超声耦合凝胶。

进行聚焦超声治疗时，将微泡试剂瓶倒置，根据小鼠每克体重取一微升溶液，轻柔地将其加入29号胰岛素注射器中。向注射器内加入100微升荧光标记的抗体，然后用拇指和食指轻轻滚动并倒置注射器，使抗体与微泡在注射器内充分混合。随后，小心缓慢地通过眶后静脉注射150微升微泡与抗体的混合溶液至小鼠体内，并设置计时器计时两分钟。

涂抹眼膏，然后将小鼠放入头部固定装置中，并将其鼻子固定在装置内。将装满超声耦合剂的小型称量皿置于小鼠头部上方，降低水袋，使其落在称量皿内的超声耦合剂上。随后使用操纵杆，通过视觉将换能器焦点对准小鼠头部中心。

当计时器响起后，在软件的运动选项卡中，选择重置原点并执行一次完整的扫描。治疗结束后，将眼用软膏涂抹于动物的眼睛，并将小鼠放入预热的恢复室中。此处展示了当微泡正确生成时，通过细胞计数仪测量所得的微泡大小和浓度的代表性结果。

通过红外扫描仪或对脑组织切片进行荧光显微镜观察，可轻松可视化抗体在全脑或组织切片中的摄取情况。如图中所示，通过小胶质细胞标志物的代表性染色，可用于判断给予抗体后小胶质细胞是否吞噬活性增强。在进行小鼠眼后注射及将换能器置于小鼠头部上方时，确保动物福利与安全尤为重要。

该方法可应用多种扫描模式，以靶向大脑的不同区域，如海马体、皮层或单侧脑半球。该技术可用于开发能够穿透血脑屏障的新疗法和药物，并用于研究血脑屏障的形成与开放机制。