植物微小RNA的检测与定量分析：RNA印迹分析法

您好。这是一个小 RNA 的 Northern 杂交实验方案，源自 Rashid Akbergenov 博士最初优化的方案。

该方法能够非常精确且高分辨率地检测长度在20至24个核苷酸之间的各种小RNA。该实验方案本质上是传统Northern杂交分析的改良形式，其中丙烯酰胺的浓度较高，为15%。这种Northern杂交可用于检测已知序列的小RNA，包括microRNA或其他类型的小RNA，也可用于验证来自下一代测序数据集的小RNA丰度。

该方法的优点在于，不仅可以检测micro RNA的丰度，还能同时检测其前体的丰度。例如，micro RNA的前体长度可能为30至数百个核苷酸，这一前体也可在检测micro RNA的同时被检测到。本实验方案非常简单、直接，但在执行本方案末尾列出的一些关键步骤时必须格外谨慎。配制10 mL凝胶混合液时，加入4.8克尿素、3.75 mL 40%丙烯酰胺溶液和1 mL freshly prepared 10X TBE（pH 8.2），并轻轻混匀溶液。

通过将混合物置于水浴中加热，使尿素完全溶解，直至溶液呈澄清状态。使用无菌 MilliQ 水定容至 10 mL，并将凝胶混合液冷却至室温。用洗涤剂清洗所需仪器，轻轻刷洗以去除残留的 TBE 和丙烯酰胺。

用 MilliQ 水进一步冲洗，并使其干燥。将玻璃板组装在一起，确保两者处于同一水平。将它们牢固地放置在海绵上。

向凝胶混合液中加入 8 µL TEMED 和 80 µL 新鲜配制的 10% APS。轻轻混匀后，将混合液倒入已组装好的玻璃板中。确保凝胶不泄漏。

小心放置梳子。让凝胶聚合约 45 分钟。凝胶聚合完成后，从装置上取下玻璃板。

用 MilliQ 水清洗玻璃板，并将其放入运行用胶板盒中。将胶板盒放入电泳槽内。

加入新配制的1× TBE缓冲液（pH 8.2）。小心移除梳子。用移液器吸取缓冲液彻底冲洗凝胶的加样孔。

此步骤可去除孔中尿素的沉淀物，使RNA在凝胶中均匀迁移。盖上电泳装置的盖子，以80伏电压预电泳30分钟，检查是否存在缓冲液泄漏。配制10 mL上样染料时，称取5 mg溴酚蓝和5 mg二甲苯青，加入10 mL去离子甲酰胺，充分混匀。

分装染料，于4度保存以备后续使用。将10微克总RNA分装至无菌的1.5 mL离心管中。确保RNA的质量，即

260:230 比值大于或接近 2。将离心管放入真空浓缩仪中，对样品进行真空干燥。用 8 µL 上样染料重新悬浮干燥的 RNA 样品。

将样品在98摄氏度加热两分钟。在室温下冷却一分钟。涡旋振荡冷却后的RNA样品，以确保其在上样染料中充分重悬。

离心管子。重复加热、冷却和涡旋步骤三次，以获得游离的RNA。停止凝胶的预运行。

在上样前，彻底清洗胶孔，以去除孔内残留的尿素沉淀。将重悬的RNA样本在98摄氏度加热一分钟。使用毛细管尖将加热后的样本趁热加入胶孔中。

避免引入气泡。将所有样品完全上样后，安装上盖。以80伏电压电泳运行三小时，或直至溴酚蓝完全跑出。

使用带正电荷的尼龙膜进行转印。将其裁剪至与玻璃板尺寸相同。在膜的右上角做好标记。

将膜轻轻放置在无菌 MilliQ 水表面，确保标签面朝下，面向水面。取一个洁净的托盘，准备用于电转印的凝胶三明治结构。将胶盒的灰色面朝下放置。

加入1×TBE缓冲液至略高于胶盒的水平。用1×TBE预湿纤维垫并挤出其中的气泡。裁剪两张与纤维垫大小相同的滤纸。

将一张滤纸用1X TBE预润湿后，放置在纤维垫上。用塑料移液管在滤纸上滚动以去除气泡。再取另一张滤纸用1X TBE预润湿后，覆盖在盒式夹具上。

滚动以去除气泡。现在，三明治结构已准备好进行电转印。电泳完成后，停止运行并从装置上取下盖子。

从装置中取出电泳胶盒。从电泳胶盒中取出玻璃板。小心地将凝胶从组件中取出。

将其覆盖在吸水纸上，使第一个上样的RNA样品位于您的右侧。将预先浸泡的膜轻轻浸入1× TBE中，然后放置在凝胶上方，标记面朝下。切勿让膜和凝胶干燥。

轻轻滚动以去除气泡。将一张滤纸浸入1× TBE中，然后铺在膜上。去除气泡。

放置另一张吸水纸，并去除气泡。将纤维垫覆盖在组件上，完成夹心结构。用力合上暗盒。

将转印槽放入模块中。用 1× TBE 缓冲液（pH 8.2）加液至印迹标记线处。盖上仪器盖子，在 4 摄氏度或低温环境中以 10 伏电压过夜转印。

在电转膜即将完成前，准备好紫外交联仪并将其设置为1200。转膜完成后，从模块中取出夹盒。将湿润的膜放在A4纸上，有标记的一面朝上。

通过254纳米紫外光以120毫焦耳照射，将RNA交联至膜上。交联后的印迹可保存于4度或直接用于杂交。设计一个与待检测的小RNA完全互补的探针。

使用PNK酶在探针的5'端进行末端标记，并按所示组合各组分。将反应混合物在37°C下孵育30分钟。孵育30分钟后，使用G-25柱从反应混合物中分离未标记的探针。

为提高探针标记效率，使用前先准备G-25柱。将印迹膜（RNA面朝上）放入杂交瓶中。使用前充分混匀杂交缓冲液。

加入10 mL杂交缓冲液，将杂交瓶放入杂交炉中，35摄氏度旋转孵育。预杂交20至30分钟。预杂交结束后，从杂交炉中取出杂交瓶。

将标记好的探针轻轻加入杂交缓冲液中，确保不要产生气泡。将印迹膜置于35°C的烘箱中，在旋转条件下孵育12小时。

杂交后，从瓶中移除杂交缓冲液。使用洗涤缓冲液-I对印迹进行快速洗涤。此步骤旨在去除印迹上残留的过量杂交溶液。

将印迹膜置于35°C下，用洗涤缓冲液-I继续孵育30分钟。随后使用缓冲液-II在35°C下再进行一次30分钟的洗涤。洗涤完成后，将印迹膜放入杂交盖膜中，去除多余的缓冲液并密封。

将其放入胶片盒中，并置于无辐射的磷屏成像仪屏幕上曝光12小时。使用Typhoon生物分子成像仪检测杂交信号，并用ImageJ软件分析结果。如需用其他探针进行印迹杂交，请按照所示步骤进行剥离处理。

利用该技术，可以估测micro RNA的丰度及其长度。从该图像中可见，所有样本中均能检测到micro RNA 397的表达。在此印迹中，根据下一代测序数据，样本一的丰度约为每百万5个读段，表明该技术亦可检测丰度较低的micro RNA。

此外，通过使用 ImageJ 定量分析软件，可以对各样本中 micro 397 的表达水平进行定量分析。本实验中我们选用 U6 和 micro RNA 168 作为上样对照。接下来我将介绍在实验过程中必须注意的一些关键步骤。

确保使用高质量的RNA进行样品制备。在真空干燥样品时，避免过度干燥。将RNA重悬于上样染料中至关重要。

确保制备流动性良好的样品。加样时需格外小心。应清洗凝胶的加样孔，并将样品沿直线加入孔内。

电转移过程中，在将膜浸入1X TBE缓冲液之前，必须将其在水中充分展开，这有助于提高转移效率。印迹杂交必须在35摄氏度下进行，需保持杂交炉的温度恒定。

为了重复使用印迹，膜必须在4度保存。应将其保持在2X SSE中湿润状态。与其他基于PCR的方法不同，该方法可确保对微小RNA的表达量进行定量，同时还能确定微小RNA的大小。