使用聚合物微滴生成装置进行甲基化特异性多重微滴PCR用于血液学诊断

本方案介绍了一种灵活的多重液滴PCR工作流程，可根据表观遗传甲基化标志物实现精确的白细胞差异计数。这种灵活性可能促进甲基化差异PCR（mdPCR）向临床应用的转化。该方法所得结果与免疫荧光染色方法获得的结果高度一致。

然而，与免疫荧光染色不同，该方法无需新鲜血液样本或昂贵的抗体。在血液学诊断中，白细胞分类计数可作为多种疾病的指征，包括感染、炎症、贫血和白血病，并且正被考虑作为癌症早期预后生物标志物。本次实验操作将由我们团队来自加拿大国家研究委员会医疗设备研究中心的技术专员 Christina Nassif 演示，共同演示者为 Abdelrahman Elmanzalawy。

首先，将20 µL蛋白激酶K与含有磁珠的400 µL裂解结合缓冲液充分混合，并加入100 µL新鲜解冻的人外周血单个核细胞（PBMCs）中。室温孵育5分钟后，将离心管置于磁力架上1至2分钟，随后移除上清液。将离心管从磁力架上取下后，用600 µL洗涤缓冲液1重新悬浮DNA-磁珠复合物，以去除非特异性结合的磁珠。

将离心管重新放回磁力架上，以去除上清液，随后用600 µL洗涤缓冲液二洗涤细胞，操作方法如前所述。去除上清液后，将离心管在磁力架上静置空气干燥1分钟，然后向管中加入100 µL洗脱缓冲液，并充分混匀。接着，将离心管置于磁力架上1至2分钟，使磁珠与目标DNA分离，随后将纯化的DNA溶液转移至新的离心管中。

对于纯化后DNA的亚硫酸氢盐转化，将20微升上述DNA样本转移至PCR管中，并向管内加入130微升转化试剂。充分混匀后，短暂离心收集管内液体，然后在热循环仪中扩增DNA。循环结束后，向置于收集管中的离子层析柱加入600微升结合缓冲液，再将DNA样品加入层析柱中。

将离心管颠倒数次以混匀，然后以最大速度离心30秒。弃去收集的流出液，向吸附柱中加入100 µL洗涤缓冲液。再次离心吸附柱，并按所示方法弃去流出液。

向柱中加入 200 微升脱磺化缓冲液，在室温下孵育 15 至 20 分钟，然后离心样品并弃去穿流液，操作如图所示。接着，每次用 200 微升洗涤缓冲液，共洗涤柱两次。第二次洗涤后，将柱转移至新的 1.5 毫升收集管中，并向柱的膜上加入 100 微升 PCR 级水。

然后，通过将离心柱在最大转速下离心一分钟来洗脱DNA。进行液滴生成时，在PCR管中将1微升经亚硫酸氢盐转化的DNA与 freshly prepared探针主混合液混合，并通过短暂离心收集样品。使用接头将一次性流体管路连接至两个250微升体积的精密玻璃注射器。

用一支精密玻璃注射器预先装入含有5%氟化表面活性剂的250微升载油，再用另一支精密玻璃注射器装入50微升载油。当两支注射器均完成装载后，将100微升PCR反应混合液注入载油注射器中，并将液滴微流控装置放置在配备高速相机的直立光学显微镜载物台上。为实时观察和记录液滴的形成过程，将预装好的注射器安装到可编程注射泵上，并使用带接头的三通连接件，将注射器管路与液滴微流控装置各入口通道的管路连接起来。

将液滴发生器出口端的管路放入0.5毫升PCR管内，调节注射泵流速至2微升/分钟，使液滴大小在收集乳液前达到稳定。缓慢而小心地从管子顶部收集乳液，并将75微升溶液转移至200微升PCR管中用于热循环。随后，确认PCR管中的油相体积与分散相体积接近，以防止热循环过程中液滴发生聚并，然后将200微升PCR管放入热循环仪中。

对于乳化样品的荧光成像，将PCR乳液转移至深度为50微米、横截面为矩形的硼硅酸盐毛细管中，以使液滴排列成紧密堆积的单层，便于成像。将毛细管固定并密封在显微镜载玻片上后，将载玻片置于倒置显微镜的载物台上。在显微镜成像软件中选择“采集”和“实时快速”模式，以启动实时相机采集。

然后，在明场和荧光显微镜下观察样品。在液滴生成和热循环完成后，可将液滴引入横截面为一毫米宽、50微米高的玻璃毛细管中。为了获得适合荧光图像采集的单层液滴分布，可针对每个波长记录图像。

图像分析后，可绘制各液滴在其相应荧光染料中的荧光强度，以确定阳性与阴性液滴的阈值。经识别与计数后，可计算每个液滴的拷贝数，并根据甲基化的 CD3Z 和 FOXP3 拷贝数相对于总细胞或 C 缺失基因的每液滴拷贝数，确定 CD3+ T 细胞和 CD4+25+ 调节性 T 细胞的百分比。随后可将这些百分比数值与使用相应抗体通过免疫荧光成像获得的结果进行比较。

我认为，从液滴生成到热循环以及最终液滴成像的整个过程中，乳液的稳定性对于获得精确、可靠且可重复的定量结果至关重要。通过定制化的PCR反应体系配制，微滴数字PCR可用于多种应用，包括癌症研究、传染病诊断以及单细胞水平的分析。