基于液滴的微流控方法与微球PCR扩增用于单链DNA扩增子

该方法有助于解答微流控系统组合技术及分子生物技术领域中的关键问题，例如微流控装置与不对称PCR方法。该技术的主要优势在于能够高效生成高度均一的微球，并且无需额外分离步骤即可产生单链DNA。该技术的应用前景涵盖多种疾病的诊断与治疗。

由于单链DNA的生成对于适配体检测实验至关重要，因此该技术可用于疾病的检测与治疗。尽管该方法有助于深入了解微机电系统（MEMS）中的三维微流控系统，但也可应用于其他用于疾病检测与治疗的系统。通常，初次使用该方法的研究人员在有效控制流体防止其反向流动方面会遇到困难。

该方法的可视化演示对于观察流动聚焦结构中微球的形成以及所生成微球的固化过程至关重要。首先，通过将基础聚合物与催化剂按10:1的比例混合，制备20毫升液态PDMS预聚物。将10毫升液态PDMS倒入置于硅片上的预制SU-8模具中，用于制作微流控网络的上部结构。

对于底部平面部分，在硅片上倒入与有模具结构时相同体积的液态PDMS，但不使用模具结构。将两片涂有液态PDMS预聚物的硅片置于预热的加热板上，在75摄氏度下固化30分钟。随后，手动将固化的PDMS层从SU-8模具上剥离下来。

将直径为1.5毫米的圆形打孔工具对准复制的微流控网络上的油相入口，以连接微米级流道与宏观流体样品，然后手动冲出通孔。重复打孔过程三次后，使用手持式电晕处理仪对上下两层PDMS进行亲水表面处理，每个样品处理数秒。

将两层经等离子体处理的PDMS堆叠，并在加热板上于90摄氏度加热30分钟，以完成PDMS与PDMS的键合过程。涡旋并短暂离心一条标准的带有丙烯酰胺标记的单链DNA探针以及一份19比1的丙烯酰胺双丙烯酰胺储备溶液。通过混合25微升40%丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液、10微升单链DNA、10微升5倍浓度TBE缓冲液以及5微升水来配制溶液一。

用50微升20%过硫酸铵制备溶液二。分别将溶液一和溶液二装入两个注射器中，并将注射器安装到注射泵上，以将溶液引入微流控平台。准备含有0.4%TEMED的矿物油，用于微球的表面固化。

将矿物油注入玻璃瓶后，将两根管路插入玻璃瓶瓶盖上的气动端口和液体端口，作为微流控储液池。将管路连接在玻璃瓶与微流控装置的油相入口之间。将管路连接至微流控装置的两个溶液入口，以便从注射泵输送两种溶液。

然后将试管插入出口端口，以将生成的微球转移至烧杯中。接下来，将注射泵的流速设置为0.4至0.7毫升每小时。使用调压阀调节压缩机的压缩空气压力。

将带有磁力搅拌子的玻璃烧杯置于加热板上，并设定旋转速度。启动注射泵，并通过电磁阀的开关控制，将外部压缩机产生的压缩空气通入玻璃瓶中。使用数字显微镜观察流动聚焦结构中微球的形成过程，以及在玻璃烧杯中生成微球的固化过程。

观察微球的形成是其中最关键的步骤之一，因为这是本研究中制备微球和微流控系统的主要过程。随后，将100微升微球转移至1.5毫升微量离心管中。然后通过轻柔离心和移液去除上清液。

使用100微升1X TE缓冲液重悬互补探针修饰的Cy3，以获得100微摩尔的终浓度。随后，将100微摩尔的互补探针修饰Cy3加入含有AP共聚微球的无菌1.5毫升微量离心管中。轻轻敲击管壁数次以混匀，并在室温避光条件下孵育1小时。

孵育结束后，弃去上清液，并通过移液去除残留缓冲液。随后用500 µL TE缓冲液冲洗三次。将微球置于75 mm × 50 mm的玻璃载片上，并在成像前覆盖铝箔。

使用40倍光学显微镜通过显微计数法获取约25个微球。随后，按照文本方案所述将所有试剂混合。将样品放入热循环仪中，并在适当条件下启动不对称PCR反应。

不对称PCR后收集上清液是最关键的步骤之一，因为这是利用微球生成单链DNA的主要过程。扩增完成后，向每个样本中加入八微升6X上样缓冲液。将每个样本中的15微升上样至2%琼脂糖凝胶中。

然后在1×TAE缓冲液中以100伏电压进行35分钟电泳。将杂交后的微球放入支架中，并将支架固定到共聚焦显微镜的载物台上。在激光控制中选择激光并打开。

在显微镜控制中选择物镜。然后在配置控制中为氰基-3选择所需的滤光片和通道。最后，启动实验并观察样本。

所构建的基于聚合物液滴的微流控平台由两层PDMS组成。采用三种微流控通道网络用于生成微球，分别为聚焦流几何结构、用于混合溶液一和溶液二的蛇形通道，以及用于微球固化的聚合通道。在微流控平台中生成微球时，使用了实验室自制的气动控制系统以实现矿物油的连续流动，以及两台用于溶液流动的注射泵。

如果微球被正确地用5'丙烯酰胺修饰的DNA探针功能化，在杂交实验中，这些荧光图像所示，微球表面应呈现出均匀的荧光信号覆盖。如果共聚反应未正确发生，光学显微镜下的微球图像将显示微球内部存在污染。利用DNA寡核苷酸探针对微球的三维表面进行操控是一种更为快速的过程，而流动式微球合成平台则可为单链DNA的扩增与纯化提供一种工具。

最初共聚的5'端AP在与互补模板退火后，可为DNA聚合提供3'端羟基。在不对称PCR实验中观察到双链DNA污染物。通过与合成的大小标记物进行凝胶电泳分析比较，证实了从微球PCR中积累得到的单链DNA产物。

在进行该实验操作时，需牢记：为了获得本方法中的扩增循环数、退火温度和探针序列，必须具备优化PCR实验所常用的方案知识及必要的调整经验。该技术建立后，为分子生物技术和生物医学领域的诊断与治疗研究者架起了连接两个研究领域的桥梁。切勿忘记，丙烯酰胺溶液具有潜在危害性，操作过程中必须采取预防措施，例如始终佩戴手套和实验服。