利用转录组学分析绘制无序致癌转录因子的结构-功能关系

对重复性和无序转录因子进行结构功能分析具有挑战性。通过将转录组学与合适的细胞环境相结合，该方法能够更有效地揭示重要的结构与功能关系。利用RNA测序作为功能性读出指标，可在单次实验中有效评估由单一蛋白质调控的所有基因，从而更有可能检测到部分功能。

部分功能检测对于致癌性融合转录因子尤为重要，因为我们尚不清楚这些蛋白质的作用机制，而对其测序可能有助于开发针对融合驱动型癌症的更优疗法。尽管我们将重点关注EWS/FLI中的无序EWS结构域，但EWS还参与其他含有功能尚未明确的无序结构域的融合蛋白。对于cDNA表达载体的转导，首先在37摄氏度水浴中快速解冻含有cDNA构建体的冻存病毒，并轻轻混入2.5微升浓度为8毫克/毫升的polybrene至每支小瓶中。

接下来，从每瓶构建物对应的1个50至70%融合度的10厘米细胞培养皿中移除培养基，并沿培养皿侧壁轻轻将全部2毫升构建物体积加入。轻柔摇晃培养皿，使病毒均匀覆盖细胞，随后将培养皿置于37°C组织培养孵箱中孵育2小时，每隔30分钟摇晃一次培养皿，防止培养皿局部区域干燥。孵育结束后，加入5毫升添加了胎牛血清、抗生素、丙酮酸钠和聚凝胺的培养基。

在细胞培养箱中过夜孵育后，将上清液更换为筛选培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养7至10天，以进行筛选和cDNA表达。筛选期结束后，将细胞收集至15毫升锥形管中进行计数，并将5至10乘以10的5次方个细胞分装至新的离心管中用于RNA测序，另将2乘以10的6次方个细胞分装至另一新离心管中用于蛋白提取。通过离心沉淀细胞，并将沉淀重悬于1毫升冷PBS中或进行5分钟离心。

然后将两种沉淀物和液氮进行速冻，并将细胞在零下80摄氏度保存。为了验证目的蛋白的敲低效果以及各表达质粒的表达情况，按照标准的Western印迹分析流程，使用相应的一抗和二抗对蛋白裂解液样本进行杂交检测。为评估RNA的质量和数量，使用基于硅胶柱提取试剂盒中的裂解缓冲液裂解用于RNA测序的细胞样本，并将裂解产物以超过13,000转/分钟的速度离心30至60秒，加载到基因组DNA去除柱中。

接下来，使用硅胶柱离心纯化法，按照试剂盒说明书对柱上的 RNA 进行洗涤。然后用 30 µL 洗脱缓冲液洗脱 RNA，并在分光光度计上分析至少 2.5 µg 的 RNA，检测 260 nm 与 280 nm 吸光度的比值，以评估 RNA 的浓度和样品质量。对于 fastq 文件分析，使用 Putty 打开终端连接至高性能计算环境，并创建一个名为 project 的分析目录。

导航至项目目录路径，创建一个用于存放压缩的原始 fastq.gz 文件的目录，命名为 fastq，再创建第二个目录，命名为 trimmed。使用适当的加密文件传输程序来传输压缩的原始 fastq 文件。

将本地存储中的 gz 文件复制到项目 fastq 目录路径，并检查每个样本是否均有 R1 和 R2 文件。进入项目 fastq 路径，按照 trim galore 中所示命令，对 fastq.gz 文件中的低质量 reads 进行修剪。

导航至项目目录路径，并创建一个名为 STAR 输出的新目录。然后导航至项目修剪后文件目录路径，使用如下所示的命令运行 STAR，以比对已修剪的 fastq.gz 文件。

找到下一步所需的输出结果，其中包含指定位置的每个转录本的计数，并使用命令读取每个基因对应的读段数输出表格文件。对于第一列，仅使用 ENSEMBL 基因 ID 列中基因 ID 小数点前的字符，以便于下游分析处理。然后使用命令将所有样本的计数汇总到名为 totcts 的数据框中，并将此原始计数数据表保存为制表符分隔的文本文件。

为了使用DESeq2定义每个构建体的差异表达谱，输入实验的DESeq2设计，并利用矩阵函数中的DESeq数据集来构建DESeq数据集，以估计大小因子并运行DESeq2。为评估分析质量，使用DESeq2提取经正则化的对数归一化计数。从DESeq2结果中提取每个转录谱的结果时，应以敲低条件或基础空载体为参照进行成对比较。

进一步使用 HGNC 基因符号对这些结果进行修正，并从 DESeq2 数据中提取包含 ENSEMBL 基因 ID、HGNC 符号、基础均值表达量以及所有构建体的差异表达数据（包括对数二倍变化量、原始 P 值和校正后 P 值）的单个文件。评估批次标准化的效果及目标样本间的相似性，使用代码调用经正则化对数归一化的计数数据，通过主成分分析和样本间距离图来检查样本的聚类情况。利用正则化对数归一化的计数数据，提取变异程度最高的 1,000 个基因构成矩阵，并基于这些基因绘制热图以进行样本的无监督层次聚类。

为了从树状图中提取感兴趣的聚类，请确定树状图中感兴趣聚类出现的层级，并将 K 设为该层级上的聚类数量。为确定哪些聚类具有生物学意义，需重新绘制按聚类排序的热图，并将每个聚类所关联的基因列表以表格形式导出，然后使用适当的生物信息学工具分析各基因聚类的生物学功能，并在不同类别之间进行比较。在此代表性分析中，可观察到使用阳性与阴性构建体实现有效的基因敲低及功能回补。

需要注意的是，DAF拯救的细胞无法形成集落，表明其致癌转化能力受损。在完成重复验证后，可获得所有样本的表型检测结果及初始RNA测序数据处理得到的基因计数，用于批次标准化和分析。若使用DESeq2进行分析时不进行批次标准化，可能会导致批次混杂效应，这很可能是由于细胞在培养传代过程中引入的生物学变异以及各批次样本处理差异所致。

在批次标准化之后，可使用 DESeq2 生成相对于基线的感兴趣构建体的转录谱。这些数据的主成分分析表明，DAF 的转录谱介于野生型 EWS/FLI 与 Delta 22 之间，证实其具有部分功能。此外，对各样本中变异程度最高的 1,000 个基因进行层次聚类分析显示，DAF 无法抑制 EWS/FLI 靶基因的表达，且仅部分保留了基因激活能力。

基因功能分析表明，DAF 激活的基因类别在功能上不同于 EWS/FLI 激活但 DAF 无功能的靶基因。有趣的是，DAF 最能够挽救由 GGAA 微卫星激活的基因，但无法挽救靠近高亲和力位点的已激活基因。将转录组学结果与相关表型实验相结合，可完成结构-功能分析。

研究人员还可以使用其他技术来研究不同转录功能的机制驱动因素。