利用阵列文库中通量筛选和双荧光素酶报告系统鉴定转录因子调控因子

本方案可用于筛选阵列化的慢病毒或逆转录病毒检测文库，以鉴定癌细胞中转录因子的新型调控因子。该技术的主要优势在于快速、中等通量、成本低廉，并且使用大多数研究人员通常可获得的仪器和试剂。为了扩增和纯化文库中的每个慢病毒载体，首先向96孔深孔板的每孔中加入1.3毫升添加了100微克/毫升氨苄青霉素的LB肉汤培养基。

每个孔中加入两微升甘油菌种，于37摄氏度、225转/分钟条件下过夜培养。次日，将每种细菌培养物转移至各自的1.5毫升微量离心管中进行离心。根据制造商说明书，使用适当的细菌质粒小提试剂盒纯化每种载体。

对于文库中的每个载体，将5 × 10⁴个293FT细胞接种至24孔板中的一个孔，并在37°C、5% CO₂条件下培养24小时。为文库中每个载体配制转染混合物：首先用无核酸酶水将每种慢病毒载体洗脱至终浓度为50 ng/μL。将每种稀释液各取5 μL加入96孔PCR板的各个独立孔中。

通过将 1.25 微升 × x 的转染试剂一与 23.75 微升 × x 的预热转染缓冲液混合，配制转染超级混合液。将转染超级混合液在室温下孵育 5 分钟。然后用移液器轻轻吹打，向该超级混合液中加入 125 纳克 × x 的 psPAX2 和 125 纳克 × x 的 VSVG。

立即将超纯混合液分装至PCR条板的各管中，并使用多通道移液器将25 µL混合物转移至稀释后的病毒载体各孔中。室温孵育20分钟后，使用多通道移液器将每孔中的30 µL转染混合物转移至预先准备的24孔板中对应的293FT细胞孔中。在细胞培养箱中孵育24小时后，将每孔中的培养基更换为500 µL新鲜的完全生长培养基，继续孵育24小时。

第二天，使用多通道移液器从每个孔中收集病毒上清液，并将每份上清液各220 µL分装到新的96孔板中的两个孔内，以制备阵列式病毒上清液板。为准备A375细胞的感染，将每种文库病毒载体分别以每孔5 × 10⁴个细胞接种于24孔板中，每孔加入0.5 mL完全培养基。每个病毒载体需额外设置一个不进行感染的孔，作为药物筛选的对照。

在细胞培养箱中孵育24小时后，将冻存的阵列慢病毒上清液置于室温下解冻，然后用200微升含有20微克/毫升polybrene的生长培养基替换预先准备好的细胞培养板每孔中的原培养基。使用多通道移液器，将每个96孔中的200微升病毒上清液转移至24孔板的对应孔中。将细胞放回细胞培养箱继续孵育24至48小时。

孵育结束后，将每孔中的培养基更换为500微升添加了嘌呤霉素的生长培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养48小时。经过48小时的嘌呤霉素筛选后，将细胞分为三到四组，使每组内所有孔的细胞密度相近，然后向每组中一个代表性孔加入200微升胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下孵育5分钟。待细胞脱落后，加入400微升含嘌呤霉素的生长培养基以中和胰蛋白酶活性，并对每个消化孔中的细胞进行计数。

用添加了嘌呤霉素的生长培养基将每种细胞悬液稀释至浓度为每毫升2 × 10⁵个细胞，并将每孔500 µL细胞接种至新的24孔板中对应的相同孔位。根据每个代表性孔的计数估算每组其余各孔的细胞数量后，向每孔加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液，使细胞浓度达到每毫升1 × 10⁶个细胞。在消化过程中，使用多通道移液器向新的24孔板中相应孔内加入400 µL添加了嘌呤霉素的生长培养基。

待细胞脱落后，轻轻混匀每个孔中的内容物，并将每种细胞悬液各100微升转移至新的24孔板中相应的孔内。随后将细胞放回细胞培养箱中继续培养24小时。为使用双荧光素酶报告基因载体转染细胞，请按照表格中的说明配制转染稀释混合液。

为配制报告基因稀释液，将每种试剂的体积乘以转染总次数再额外增加若干体积，混合各试剂。接着，将转染稀释液与报告基因稀释液混合，室温孵育15分钟，制备转染混合液。孵育期间，用250 µL PBS冲洗细胞培养板的每孔，并向每孔加入447 µL新鲜的完全培养基。

然后使用多通道移液器将53 µL转染混合物分配到细胞培养板的每孔中。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。为检测荧光素酶活性，用去离子水将荧光素酶活性检测试剂盒中的5×被动裂解缓冲液按1:5比例稀释，并将试剂盒中所需的试剂A和试剂B缓冲液体积解冻。

当试剂准备就绪后，将每孔中的上清液更换为75微升裂解缓冲液，室温下孵育30分钟，期间偶尔振荡。孵育过程中，将试剂盒中的50倍浓缩的试剂B底物用已解冻的试剂B缓冲液稀释至1:50的工作浓度。孵育结束后，向四个空白对照孔中各加入30微升裂解缓冲液，并将每孔中的30微升裂解物转移至96孔白色平底检测板的复孔中。

当所有裂解液加样完毕后，使用多通道移液器向每孔加入 50 µL 试剂 A，并用酶标仪检测萤火虫荧光素酶信号。然后使用多通道移液器向每孔加入 50 µL 试剂 B，并用酶标仪检测海肾荧光素酶信号。与对照载体相比，YAP2SA 增加了萤火虫荧光素酶活性，但对海肾荧光素酶活性无影响。

相比之下，YAP2SA S94A 不会增加萤光素酶活性。重要的是，YAP2SA 不会改变缺乏 MCAT TEAD 结合元件的最小启动子结构的活性。在转染了 YAP-TAZ-TEAD 报告基因结构的细胞中，串联的 YAP 和 TAZ 短发夹显著降低了萤光素酶水平，但对照短发夹（非靶向对照）则无此效应。

相比之下，在转染了最小报告基因构建体的细胞中，YAP-TAZ 短发夹 RNA 并未显著改变萤火虫荧光素酶的水平。每个孔中的海肾荧光素酶信号也未受到短发夹非靶向对照或 YAP-TAZ 短发夹 RNA 的显著影响。正如预期，靶向 YAP 和 TAZ、SARC 或 PI3 激酶的短发夹 RNA 显著降低了 YAP-TAZ-TEAD 活性。

靶向ATM、CDH1、CSK、ERBB2和gelsolin的短发夹RNA均使标准化的萤光素酶水平升高，这与已发表的研究结果一致，表明这些蛋白与YAP和/或TAZ相关。尽管ATR、CCNE2和ERBB4在其他细胞类型中具有明确的功能，但靶向这些基因的短发夹RNA并未显著改变A375细胞中的标准化萤光素酶水平。在完成此筛选后，应通过其他检测方法验证所鉴定出的调控因子对其转录因子活性的影响。

还应通过实验确认已有效敲低所鉴定的调控因子。操作具有感染性的慢病毒时，务必保持谨慎并遵循安全操作规范，特别是当病毒具有人类感染性时。