使用微流控网络与标准灌流室刺激脑切片

我们今天要向您展示的项目主要目标是能够对脑部刺激进行空间和时间上的精确控制。另一个关键点是，通过对现有复杂的电生理装置进行简单的改造，我们便能将这种微流控设备推广到目前实际使用脑片刺激技术的各个实验室中。大家好，我是来自伊利诺伊大学芝加哥分校生物工程系埃丁顿实验室的 Java Chek Mohammad。

今天，我将向您展示如何应用一种简单的微加工微流控装置来刺激脑片。我们今天要演示的脑片装置具有多种用途，其主要优点在于模块化设计，可直接适配现有的电生理实验装置，无需额外修改。此外，该装置避免了管路和泵的使用，从而简化了微流控系统的复杂性。

由于我们采用的是被动泵送方法，因此不需要任何管路或泵。第三点是，它仅是一层薄薄的PDMS膜，置于盖玻片与标准灌流室之间，而该灌流室常用于标准的电生理实验装置中。我今天将演示的实验流程始于一个C八母模，该母模是通过标准的SV八光刻工艺制备而成的。

今天我们所使用的模具是一个双层模具，其中一层包含微通道的结构设计，另一层则设计有通孔开口（via openings），位于这些通道的上方，使得流经通道的溶液能够通过这些通孔流出。我们首先在硅晶圆上制作出该模具，然后将硅胶或聚二甲基硅氧烷（PDMS）浇注在该装置表面，将晶圆上的结构复制到PDMS中，从而形成相应的模具结构。因此，我们将把PDMS浇注到该装置的表面。

然后，我们将取固化后并与盖玻片键合的PDMS膜，从而获得我们的微流控装置。接着，我们将通过在灌流 chamber 底部涂布一层薄薄的PDMS，来改造一个标准的灌流 chamber。

完成这种改造后的灌注腔室后，我们将取之前制备的微流控装置，并将其键合到灌注腔室上。微流控装置的制备过程中有两个关键步骤：其一是，在倒入PDMS之前，应关闭加热板，以防止PDMS倒入晶圆时立即开始聚合。

另一个关键点是，我们用于硅片四个角落的垫片，其高度应小于硅片上最高的结构，以确保在对 PDMS 进行固化处理时能够获得 VR 开口。这里是我们所在的软壁模块化洁净室，此为采用标准的交流八号光刻工艺制备的母模。

这是一个两级结构的模具，第一级包含具有四个入口和一个出口的通道设计。在四个通道的中间区域，有位于通道上方的通孔或凸起。这些是在制造过程中形成的对准标记。

现在我将向您展示如何将其去除并进行PDMS固化。由于边缘液滴效应，晶圆外围区域的厚度大于纸张中心实际器件区域的厚度。因此，我们将使用反向刀片去除这些对准标记，然后为了放置配重块，我们将使用高度为140微米的垫片，并将其置于晶圆的四个角落。

因此，您需要确保剃刀片不要靠近实际的器件。现在我将使用气吹清除这些SVA颗粒，晶圆现已准备好进行PDMS模具的制备。但在进行此操作之前，我们需要放置这些高度为140微米的间隔片。

我将把四条胶带贴在晶圆的四个角上。然后我会确保胶带已正确粘附在晶圆表面。胶带高度为140微米的原因是，带有微通道和VS的双层模具高度为150微米。

在PDMS固化过程中，当我们将重物放置于PDMS顶部时，需确保PDMS片材最终平整。因此，我们在四个角落使用高度相同的四个间隔垫片。接下来，我将演示如何对PDMS进行编码并固化以制备器件。

但在进行之前，让我先向您展示我们是如何制备PDMS溶液的。首先，我们取10份基底材料和1份固化剂，充分混合。由于混合过程会产生大量气泡，为了去除这些气泡，我们将PDMS放入真空干燥器中。将PDMS置于真空干燥器中10分钟后，其中的气泡便完全消失了。

现在，聚二甲基硅氧烷（PDMS）已准备好用于固化。接下来，我将向您展示如何将PDMS涂布在硅片上并进行固化，以获得PDMS膜。因此，我将把PDMS涂在硅片上，然后使用这张透明薄膜覆盖PDMS。

这将帮助我们去除装置支撑物，将装置与透明膜分离，然后在透明膜上方放置重物。使用重物的目的是获得均匀厚度的PDMS。另一个关键问题是形成通孔开口。

因此，凡是有 vs 的地方，我们都不希望有 PDMS，而配重将帮助我们实现这一点。正如您在此处所见，加热板已关闭，原因是避免 PDMS 立即固化，因此我们让其保持关闭状态。然后，在将 PDMS 转移至晶圆之前，您需要确保晶圆表面平整。

现在我们可以浇注之前准备好的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。务必确保将PDMS滴加在靠近晶圆的位置，以免产生气泡。此处最关键的步骤是将透明盖片放置在PDMS上方的方式。

您需要确保在放置薄片时不会产生气泡。现在我将放置一块玻璃片，让多余的PDMS排出。我将再放置三块玻璃片，并确保这些玻璃片在此特定模具上不会移动。

对于这些特定结构，我们发现放置四个玻璃片可形成通孔（via）。这样可使多余的聚二甲基硅氧烷（PDMS）从透明膜与晶圆之间的间隙中排出。我们等待一到两分钟，然后即可开启加热板。针对不同的母版和不同的设计，可能需要增加或减少玻璃片的数量，以获得理想的通孔开口。现在加热板已准备就绪，我将温度设置为75摄氏度。

当温度达到75摄氏度后，即可将计时器设定为一小时，使PDMS固化。现在我们已让PDMS固化一小时，可以关闭加热板，使其冷却至50摄氏度。这样操作的目的是防止SEA发生开裂。

如果我们将它从75摄氏度立即降至室温，现在可以关闭加热板，等待其温度降至50摄氏度。当加热板温度降至50摄氏度后，我们可以从透明膜上取下重物。现在可以将晶圆从加热板上取出，即可进行切割。

现在PDMS片已准备好从a C eight模具上取下，我们需要移除铝箔。然后需要取下透明胶片。这里是我们标准的灌流 chamber。

我们对其进行了改造，以便能够进行对齐，包括微流控装置的孔洞、入口和出口端口。因此，这分别是PDMS膜上的四个入口端口和一个出口端口。

这些应与灌注室上的四个入口和一个出口相匹配。现在我将滑动灌注室，然后将其与PDMS膜上的孔对齐。对齐后，即可进行切割。

现在可以将腔室取出，并使用探针操作。确保PDMS膜的所有边缘均可被顺利取下。完成此步骤后，可使用冷冻设备将PDMS膜移除；在从装置顶部取下PDMS时，务必缓慢移动，以免撕裂PDMS膜。

现在，我将把带有微腔的PDMS膜放置在由SC八通道模具形成的顶部，并确保其平整。我们这样做的原因是，在打孔制作进样口和出样口时，与盖玻片将要键合的一侧PDMS表面不会变得粗糙。

因此，我们需要确保空腔位于上方。现在可以制作进样口和出样口，以便更清楚地观察孔洞。我们放置一个黑色背景。

现在我将制作进样口和出样口，并确保端口处没有残留的PDMS。因此，我们需要清除所有PDMS。接下来，我们将把PDMS膜转移至另一张透明薄膜上。

因此，我们可以对板材和盖玻片进行等离子处理，并将它们放置好，使腔体仍然朝上。当此表面和盖玻片均经过等离子处理后，便可将这两个表面贴合在一起，形成微流控网络，并去除PDMS板材之间的气泡。可使用透明胶带增加透光性。

这样可确保PDMS片平整，使键合效果更好。然后再次使用透明胶带粘贴PDMS膜的上表面，以去除任何灰尘。现在我们可以放置将与PDMS膜键合的盖玻片。

现在，这两块PDMS和玻璃已准备好进行等离子处理。我们将使用这种经微波改造的等离子系统对PDMS和盖玻片进行等离子处理，可以看到该玻璃腔室允许我们在微波内产生等离子体。接下来，让我将样品放入腔室内，并在腔内创建真空环境。

现在我可以通入氧气。现在等离子体系统已准备就绪，我将为此特定系统使用10%的功率和10秒的时间，以帮助观察等离子体。在等离子体处理过程中，我们将功率调至100%，并关闭了灯光。

现在，等离子体处理后，您可以看到等离子体。您需要将牛滑片和PDMS的两个表面立即键合，否则PDMS表面会因等离子体处理而失去亲水性。放置牛滑片后，务必确保整个表面完全键合，且无任何气泡。

如果有气泡，可以将其去除。现在将其静置五分钟，使其充分结合。此处展示的是经过改良的灌流室，我们已使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）对灌流室的基底进行了改造。

这一步骤之前已完成。我们将一张透明膜放在已关闭的加热板上，然后倒入之前以类似方法制备的P-D-M-S-P-D-M-S。

然后将灌注室置于PDMS上，并如图所示放置一个配重，随后在75摄氏度下固化30分钟。现在，在等待PDMS与盖玻片键合的过程中，我将演示如何继续准备该腔室。因此，我们可以进行腔室与微流控装置的键合操作。

因此，我们需要将不需要位置上的多余PDMS去除。先移除透明膜，然后去除PDMS，接着需要将入口和出口端口处的PDMS清除。现在，该腔室已准备好与我们先前制备的微流控装置进行键合。

现在我们已经等待了五分钟，微流控装置已准备好从透明膜上分离，但您需要确保以缓慢的速度移除透明膜，以防止PDMS与盖玻片发生分离。现在灌注室已准备就绪，我们需要对灌注室的底面进行等离子处理，即之前粘附PDMS的表面，同时对微流控装置的顶面（带有PDMS的一面）进行等离子处理。

现在，我们将把这两个部件都放入等离子体腔室中，在10%功率下进行10秒的等离子体处理。目前两个表面均已接受等离子体处理，可以进行键合。在键合之前，您需要确保腔室上的进样口和出样口与微流控装置对齐。

由于我们所要对齐的特征尺寸足够大，因此不需要任何特殊设备，仅凭肉眼即可完成。对齐并将其放置在腔室上方后，确保所有表面均充分接触，然后静置五分钟。等待五分钟后，键合效果已足以满足实验要求。

现在微流控装置已与腔室键合，接下来我们将使通道表面的通道内壁具有亲水性。这样，当我们实际通入CFS溶液或其他任何神经递质时，溶液能够更顺畅地流过通道。为此，我将把整个装置放入等离子体中，以10%功率处理一分钟，从而使通道内部表面完全亲水化。

然后我会用水将其注满，再将其拿到电生理实验装置处，以便进行实际的实验。好的，现在我们已准备好前往电生理实验装置，并将此设备与脑片一起使用。大家好，我叫 uo。

我正在与伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校生物工程系的Dr. Arrington和Dr. Fall合作。现在，我将要使用带来的微型自由装置，并将其放置在此平台之上。在装置的一侧，我们可以看到灌注管路。

在另一侧，我们可以看到吸液管路。该装置将灌注脑脊液溶液，溶液经95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和。现在微型V装置已准备就绪，我将取脑组织切片，并将其放置在微型V装置上。

现在，我将把脑切片放置在圆形开口的上方，然后使用固定锚来固定脑切片。脑切片固定好后，我将使用神经递质对其进行刺激。此处共有四个进液口，我将通过这四个进液口的被动泵送方式，将神经递质注入，直至液体从出口流出。

现在，Fall 博士将介绍这个设备。它对我们来说为何如此重要？大家好，我是 Chris Fall，我们从事脑生理学研究。

我们需要使用脑切片的原因是为了能够接入微电极并使用成像技术。迄今为止，我们唯一能够改变这些脑切片神经递质环境的方法是改变流经整个切片的灌流液，或使用非常细小的微移液管直接向局部喷射神经递质。因此，我们非常高兴能与Eddington研究组合作。

这项新技术将使我们能够作用于大脑的广大区域，并局部改变神经递质环境。同时，我们现在可以利用电极和成像技术进行监测，或许最终还能在同一装置中集成多电极记录设备。好的，这里您看到的是微流控装置中的一片小鼠脑切片。

你甚至可以凭肉眼观察到，大脑由许多不同的区域组成。这些区域具有不同的功能。在活体动物中，大脑的不同区域会具有不同的神经调节物质和神经递质水平。

我们希望在进行电生理和成像记录的同时，能够在脑片记录室中模拟这一过程。因此，能够以不同的神经递质、不同的浓度以及不同的时间进程来靶向这些不同脑区，具有重要意义。虽然我们无法直接观察神经递质，但可以在此展示一个示例：荧光染料被泵入脑片的不同区域。

在此视频中，您可以看到荧光染料流经装置的通道，并从已制备的孔隙中流出的可视化过程。即使是在这一早期原型中，您也能观察到流动的空间分辨率非常精确。当我们观看视频时，您将看到染料流入通道，然后从孔洞中流出，随后我们将冲洗掉该染料，从而让您了解流动的时间分辨率。

感谢您今天的参与。我认为我们已经能够展示微流控技术以及微型机械如何与传统生理学技术相结合，以帮助我们理解大脑的工作机制。谢谢。