使用 CRISPR/Cas9 技术制备并注射 Culex 蚊胚胎以产生无效突变

本方案具有重要意义，因为它提供了关于如何制备和注射蚊子胚胎以进行CRISPR-Cas9基因组编辑的详细操作步骤。该显微注射技术的主要优势在于蚊子胚胎存活率高，并且能够帮助研究人员确定基因的功能。本方案已针对属于库蚊属（Culex）的蚊子进行了专门优化。

这些蚊子可传播多种病原体，包括引起西尼罗河热和圣路易斯脑炎的病毒，以及导致犬心丝虫病和象皮病的丝虫类线虫。因此，拥有CRISPR-Cas9基因组编辑等工具，将有助于我们更深入地理解并控制这些重要的致病因素。向新产的昆虫胚胎注射并提高其存活率，需要大量时间、实践和耐心。

因此，我们建议在使用昂贵材料进行突变体构建之前，先用有色生理盐水溶液注射若干胚胎以进行预实验。首先，用注射混合液从针尖后方填充注射针。选择适合所选注射针后端口径的针头填充器或凝胶加样枪头，以便轻松插入注射针后端。

确保针头填充物的末端与注射针之间留有少许间隙。小心抽吸，使注射混合液在注射针开始变细的位置附近形成一个微小液滴。然后将注射针连接到显微注射器上。

将含有胚胎的载玻片放置在显微镜载物台上。为打开注射针，起始注射压力设为约 30 Psi，并根据需要调整压力，以注入适量的注射混合液。在解剖显微镜下，将注射针置于蚊子胚胎上方，使用显微操作仪小心地将注射针缓慢下降至胚胎上。

当针尖刚刚接触到胚胎时，迅速将胚胎沿针的长轴垂直方向移动。要判断针尖是否已成功打开，可按压注射触发器，观察是否有气泡或注射混合物从针尖逸出。如果没有，需重复将蚊子胚胎抵向针尖的操作，直至针尖打开，并且在按压触发器时有注射混合物逸出为止。

将第一只蚊子胚胎置于视野中央，确保其处于焦距范围内，并将针头移至第一枚卵的上方。逐步增加显微镜的放大倍数，同时小心降低针头，使其始终保持在第一枚胚胎的上方附近。继续操作直至显微镜达到最高放大倍数，且胚胎与针头均清晰对焦。

将胚胎轻微向左移动，并降低针头，使其与胚胎处于同一观察平面。使用显微镜载物台轻轻触碰胚胎，使其接触针尖。蚊子胚胎狭长的后端应略微偏转。

使用显微镜载物台，将胚胎的后端移至针尖上，并观察针尖刺入蚊卵的卵壳。针尖应刚好穿透膜结构，并到达胚胎内极细胞的大致位置。将注射混合物注入该区域，可提高突变发生的可能性，并增加突变通过生殖系遗传的几率。

拉动注射触发器一至三次，将注射混合液注入胚胎。注入少量注射混合液，以在胚胎胞质中刚好出现轻微透亮区为宜。利用载物台将胚胎向右移动，使其脱离针尖。

如果注射顺利，胚胎中应几乎没有或完全没有液体渗出。将载物台下调，使下一个胚胎位于针头前方，然后重复注射操作。

如果未见注射混合液流出，或拔出针头后有大量液体从胚胎中溢出，则需更换注射针头并重新开始。将所有未注射或受损的卵销毁。载玻片上所有胚胎注射完毕后，用喷瓶加入反渗透水，洗去卤代烃油。

将水流对准已注射胚胎上方的玻璃盖玻片顶部，使水沿盖玻片流下，注意避免水流直接冲击胚胎。在载玻片上加入 150 µL 水，并将其置于方形培养皿内湿润的滤纸上。将培养皿放入环境培养箱中，设置温度为 25 至 27 °C，相对湿度为 70% 至 80%，并采用长日照光周期进行培养。

本方案已成功用于北方家蚊（Culex pipiens）胚胎的显微注射，确保蚊子胚胎的前端延伸至医用敷料条之外，显著提高了幼虫的存活率，并获得了高质量的子代，这些子代能够正常发育至成虫阶段并繁殖后代。测序结果显示，约10%的筛选蚊子在第一条向导RNA的Cas9切割位点附近出现小片段插入或缺失，表明在显微注射过程中极细胞被成功靶向。F1代个体成功交配并产生可育后代，其中部分后代也携带该突变。

在显微注射昆虫胚胎时，大多数人在最初打开针头并将胚胎移至针头上的步骤中会遇到困难。请记住，掌握这些技能需要时间和练习。本实验方案可进行修改或调整，以适用于其他蚊虫甚至其他昆虫物种的胚胎注射。

除了使用本方案通过靶向的 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术敲除基因外，相同的技术还可用于注射质粒或转座子，以实现基因敲入或产生随机突变。我所在的实验室目前正在利用该技术深入研究蚊子如何测量昼夜节律并调控其季节性反应。然而，我们研究人员正通过 CRISPR-Cas9 基因组编辑技术，进一步揭示多种生物的生物学机制。