高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊
2020年5月24日
本方案描述了适用于Culex quinquefasciatus胚胎的显微注射操作步骤，该方法已优化以配合CRISPR/Cas9基因编辑工具使用。该技术可高效产生位点特异性、可遗传的生殖系突变，可用于在此类研究尚不充分的疾病媒介中构建遗传学技术。
胚胎显微注射技术为开发多种基于遗传学的病媒控制工具奠定了基础。尽管已有多种昆虫建立了较为完善的实验方案，但对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）的研究仍相对不足。本显微注射方案专门针对致倦库蚊独特的生物学特性设计，包括卵的收集、卵筏的分离以及注射后的处理步骤。
该方法可能适用于任何感兴趣的库蚊属物种，可用于研究基因功能或开发基于遗传学的库蚊属物种防控技术。首先将卵从卵筏中分离出来。使用镊子或画笔按压卵筏，将单个卵分离散开。
将卵整齐排列在置于载玻片顶端的细条双面胶带上，尽量使每个卵的前端朝向一致。通过轻轻混合卤代烃试剂与水配制卤代烃混合液，并在25摄氏度下孵育过夜。用卤代烃油混合液覆盖已排列好的卵。
为制备显微注射用针头，将铝硅酸盐毛细玻璃管放入拉针仪中，并按照制造商的说明进行操作。将加热温度设为560，拉速设为100，延迟设为70，拉力设为97，气压设为500，然后启动拉针仪。
将拉制好的针尖以50度角轻轻接触旋转的金刚石研磨板，研磨约10秒钟，以使针尖形成斜面。将拉制并研磨好的针插入培养皿中模型黏土的凹槽内固定。配制基因组修饰试剂的注射混合液，并将其置于冰上保存。
使用微量进样头将 2 µL 注射混合物装入注射针中。将装有液体的注射针放入与电子显微注射仪相连的显微操作器中，并将放置了排列整齐的卵的载玻片置于复式显微镜的载物台上。通过显微操作器，调整注射针的角度，使其对准胚胎后端，角度保持在 25 至 35 度之间。
小心将针头插入胚胎，并注入约相当于胚胎体积10%的混合物。每次注射20枚卵后暂停，并进行胚胎回收操作。注射后20分钟内，用干净的画笔轻轻刷拭卵，小心去除卵上的卤代烃油。
用画笔将卵轻轻挑起，放入盛有双蒸水的杯子中，注意保持卵位于水面。在接下来的七天内，每天检查卵的孵化情况，并按照正常的幼虫饲养程序进行操作。使用体视显微镜对注射后的蚊子进行突变表型筛选。
该方法已成功用于产生对深色眼色素发育至关重要的基因的体细胞和生殖系突变。通过检测显微注射个体在瞳孔期眼睛色素缺失的情况，对CRISPR-Cas9诱导的体细胞突变进行表型评分。体细胞突变通常表现为嵌合表型，即部分而非全部细胞呈现突变表型。
通过杂交嵌合型G零代个体并统计完全白眼后代的数量，确定了种系突变率。这些实验得到的胚胎存活率为64%至82%，体细胞诱变率为37%至57%，种系诱变率则高于61%。通过多重化sgRNA以在同一基因内靶向多个位点，体细胞和种系诱变率可提高至高达86%。此外，实验室已成功将白眼突变体的可育纯合品系维持多代。
为了优化存活率和诱变率，在进行显微注射之前，应妥善准备所有材料，包括卤代烃油、注射液和针头。这将使显微注射过程更加高效和集中。
概述
本方案概述了对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）胚胎进行显微注射的技术，专为CRISPR/Cas9基因编辑优化。该技术可高效产生可遗传的生殖系突变，适用于遗传学研究及媒介控制技术。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因工程
- 载体生物学
- CRISPR/Cas9 技术
背景
- 致倦库蚊是一种研究尚不充分的疾病传播媒介。
- 显微注射技术对于开发遗传控制工具至关重要。
- 针对其他昆虫物种的现有实验方案已较为成熟。
- 本方法针对库蚊属物种独特的生物学特性进行了优化。
研究目的
- 建立针对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）的显微注射方案。
- 推动基因功能研究及遗传控制技术的发展。
- 优化注射后胚胎的存活率与诱变效率。
使用的方法
- 卵的收集与卵筏分离技术。
- 卤代烃油及注射混合液的制备。
- 使用显微操作仪对胚胎进行显微注射。
- 注射后对突变表型进行筛选。
主要结果
- 胚胎存活率达到 64-82%。
- 体细胞突变率范围为 37-57%。
- 生殖系突变率超过 61%。
- 多重 sgRNA 的使用使突变率提高至 86%。
结论
- 该方案可成功产生体细胞和生殖系突变。
- 实验室中维持了具有活力的纯合突变体品系。
- 材料的充分准备可增强显微注射过程的效果。
常见问题
行业重要性概要
高效的胚胎显微注射技术可实现对致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）的位点特异性诱变，该蚊是西尼罗病毒和淋巴丝虫病等疾病的重要传播媒介。该技术通过产生可遗传的突变，支持功能基因研究中的靶点验证和早期发现阶段的机制性风险排除。本实验方案针对该物种特有的技术障碍进行了优化，有助于提高在媒介控制靶点筛选和临床前模型开发中的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在与疾病相关的昆虫媒介中实现精确的基因敲除，能够验证治疗性假设。
- 操作价值：提供一种可重复的方法，用于产生生殖系突变，以功能验证参与病原体传播的靶基因。
- 预测价值：通过将基因破坏与媒介传播能力相关的关键表型结果关联起来，支持项目组合的优先筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可量化的诱变读数（体细胞和生殖系突变率），用于评估不同向导RNA设计的编辑效率。
- 操作价值：标准化胚胎处理和显微注射条件，提高不同实验批次间检测的可重复性。
- 可扩展性：支持多重sgRNA递送，以提高诱变率，适用于高通量靶点筛选。
转化与临床前研究
- 科学价值：产生可遗传的白眼突变体，以建立稳定的遗传品系，用于长期的表型和遗传特性研究。
- 操作价值：胚胎存活率达到64–82%，确保获得足够数量的可存活突变体，用于后续表型筛选。
- 转化连续性：在多代之间维持可存活的纯合突变体种群，支持对基因控制策略的临床前评估。
流程与工作流整合
该方法通过在研究尚不充分的媒介物种中实现功能基因组学研究，契合了从靶点假设到先导物鉴定的发现连续过程。
- 发现生物学：通过CRISPR/Cas9介导的诱变支持假设验证，以阐明病原体-媒介相互作用中的基因功能。
- 筛选：提供定量的诱变率（体细胞37–57%，生殖系>61%），用于比较向导RNA的有效性并优化编辑条件。
- 分析：通过立体显微筛选实现突变表型的评分，为阳性结果验证提供可量化的输出数据。
- 转化研究：通过生成稳定的突变品系，促进从基因发现到临床前模型开发的连续性研究。
- 企业级应用：建立可适用于多种库蚊（Culex）物种的标准显微注射流程，减少重复的方案开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在虫媒疾病模型中实现基因型与表型的直接关联，减少机制上的模糊性。
- 操作价值：通过标准化的卵排列、卤代烃覆盖及针头制备步骤，提高实验可重复性。
- 战略价值：通过提供对媒介生物生存或病原体传播至关重要的靶标的生物学功能验证，优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于可遗传的突变率和表型严重程度，实现对靶标的动态风险评估与优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备胚胎操作、显微操作以及荧光或立体显微镜筛查方面的专业知识。
- 依赖于拉针仪、显微注射仪以及卤代烃油的制备，以维持胚胎活力。
- 需要不同团队在卵收集和卵筏分离技术方面进行标准化统一。
- 在不同库蚊物种间应用时，可能需要调整注射体积和针头几何形状。
- 实际限制因素包括胚胎脆弱性，以及注射后需立即恢复以维持存活率。
