可视化复制体与抗原标记阻断损伤位点的相互作用

该技术有助于可视化复制体抗原标记的DNA加合物相互作用，并可扩展应用于任何蛋白质与适用于免疫检测的DNA结构或损伤位点之间的相互作用研究。该方法可用于评估单个细胞内的相互作用频率，而非整个细胞群体的平均值，同时能够在不损伤细胞的情况下原位观察细胞周期依赖性的相互作用。本实验操作将由来自Seidman实验室的博士后Ishani Majumdar进行演示。

实验前一天，将1.5 × 10⁵个细胞接种于2 mL培养基中，加入经细胞黏附溶液预处理的35 mm玻璃底培养皿内。次日，将每皿中的上清液更换为37 °C、含5 µM Dig TMP的培养基，作用于50%–70%融合度的细胞培养物，并将培养皿放回细胞培养箱中孵育30分钟，使Dig TMP充分平衡。在细胞孵育的同时，将紫外照射箱预热至37 °C。

平衡结束后，将培养板转移至预温的盒子中，使细胞暴露于5分钟、3焦耳/平方厘米的UVA光照剂量下，然后将上清液更换为2毫升新鲜的预温培养基，再将培养板放回细胞培养箱中孵育1小时。孵育结束后，用PBS轻柔洗涤细胞，随后加入1毫升含0.1%甲醛的PBS溶液，在室温下固定细胞5分钟。固定结束后，用PBS洗涤细胞一次，然后在室温下每次加入80微升含RNase的细胞骨架提取缓冲液，处理两次，每次5分钟，以去除细胞质成分。

第二次孵育后，用两毫升 PBS 洗涤细胞三次，然后在室温下用一毫升含 4% 多聚甲醛的 PBS 固定细胞 10 分钟。第二次固定后，如所示用 PBS 洗涤细胞三次，随后加入一毫升预冷的 100% 甲醇，在 -20 摄氏度处理 20 分钟。孵育结束后，用两毫升 PBS 洗涤细胞三次，然后在 4 摄氏度下用 80 微升 5 毫摩尔的 Triton X-100 孵育 10 分钟。

孵育结束后，加入100微升含5毫摩尔EDTA的PBS溶液，并补充1微升浓度为100毫克/毫升的RNase A，在37摄氏度下处理细胞30分钟。孵育结束后，用PBS洗涤细胞三次，然后将细胞置于含5%牛血清白蛋白和10%驴血清的PBS溶液中，于4摄氏度湿盒内过夜保存。进行邻近连接实验时，向每孔板中央加入40微升目标一抗溶液，于37摄氏度湿盒中孵育1小时。

孵育结束后，用两毫升 PBST 将细胞洗涤三次，然后每皿加入 40 微升新鲜配制的 PLA 探针溶液，在细胞培养孵育箱中孵育一小时。孵育结束后，在室温下于倾斜平台上用两毫升缓冲液 A 进行三次、每次 10 分钟的洗涤。最后一次洗涤后，每孔加入 40 微升新鲜配制的连接混合液，在 37 摄氏度孵育 30 分钟，随后在倾斜平台上用缓冲液 A 进行三次、每次两分钟的洗涤。

最后一次洗涤后，在湿盒中，向每孔加入 40 µL 新鲜配制的扩增溶液，37 °C 孵育 100 分钟。孵育结束后，在倾斜平台上用新鲜缓冲液 B 洗涤细胞 6 次，每次 10 分钟。最后一次缓冲液 B 洗涤后，在室温下用 0.01× 缓冲液 B 洗涤细胞一次，持续 1 分钟，随后在湿盒中加入相应的二抗，37 °C 标记 30 分钟。

孵育结束后，在室温下将样品置于倾斜平台上用PBST洗涤三次，每次10分钟，随后将样品封片于含DAPI的封片剂中。封片后四天内，使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对每种样品或条件下的至少100个细胞进行成像，实验组与对照组均采用相同的曝光参数设置。可通过免疫荧光检测Dig标签，以显示细胞核内链间交联的存在情况。

为了可视化复制体与链间交联的相互作用，可在引入链间交联后一小时，应用PLA检测MCM5与Dig标签的共定位频率。由于复制应激会激活ATR激酶，因此pMCM在丝氨酸108位点的磷酸化形式（pMCM S108）与Dig标签之间的PLA信号也呈阳性。单个细胞核的PLA结果可通过三维重建呈现，从而实现对整个细胞核内复制体与链间交联相遇情况的可视化观察。

复制叉分析表明，当复制叉遇到链间交联时，会出现一种出乎意料的复制重启现象，因为GINS复合物的蛋白质未能与链间交联产生PLA信号。相比之下，CD45的检测结果为阳性，表明另一种锁合蛋白仍被保留。当细胞经ATR抑制剂孵育后，复制重启被完全抑制，而GINS Dig PLA则呈现强阳性。

CSK+R 处理对于降低背景信号至关重要。务必用细胞粘附剂包被培养板，并用 0.1% FA 预处理，否则细胞会从培养板上脱落。