在单分子水平上观察量子点标记蛋白与位点特异性修饰的λ DNA之间的相互作用
2018年7月17日
本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM），结合位点特异性修饰的λ DNA底物和量子点标记的蛋白质，研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。
该方法有助于解答DNA-蛋白质相互作用领域中单分子成像的关键问题，例如DNA复制、基因修复以及染色体结构的维持。该技术的主要优势在于，能够获得经修饰的λDNA高拷贝数，并快速固定标记的蛋白质。此方法的可视化演示至关重要，因为流动池组装步骤较难掌握。
清洗盖玻片时，将20个盖玻片放入四个染色缸中，加入乙醇并在乙醇中超声处理30分钟。然后用超纯水冲洗盖玻片三次。接着用1摩尔氢氧化钾溶液超声处理盖玻片30分钟，并再次用超纯水冲洗盖玻片三次。
然后重复一次乙醇和氢氧化钾的超声处理。用丙酮对盖玻片超声处理30分钟，再用超纯水彻底冲洗。将盖玻片放入piranha溶液中，在95摄氏度下孵育1小时。
孵育结束后，用超纯水将盖玻片冲洗五次。然后用超纯水充分洗涤每片盖玻片。用纸巾从盖玻片边缘吸干水分，并将盖玻片放入染色缸中。
将盖玻片在110摄氏度的烘箱中彻底干燥。随后用甲醇冲洗盖玻片，然后将染色缸重新放回110摄氏度的烘箱中以干燥盖玻片。进行盖玻片功能化时，向每个染色缸中加入70毫升硅烷溶液，拧紧瓶盖，并在室温下静置过夜。
使用三个盛有超纯水的烧杯清洗盖玻片。用氮气彻底干燥盖玻片。将150毫克甲氧基-PEG和6毫克生物素-PEG溶解于1毫升新配制的0.1摩尔碳酸氢钠溶液中。
在17,000 × g条件下离心1分钟，以去除不溶性PEG。然后将100微升PEG溶液加到硅烷化盖玻片的中央，再将另一张硅烷化盖玻片覆盖在其上方。将盖玻片与PEG溶液在避光条件下孵育至少3小时。
将盖玻片成对分开，并使功能化表面朝上放置。用超纯水彻底冲洗盖玻片，并用氮气吹干。然后用记号笔在盖玻片的一角标记功能化表面的一侧。
将一个盖玻片放入一个盖子上钻有单孔的50毫升离心管中。将该离心管放入塑料袋内，使用真空封口机密封袋子，并于-20 °C条件下保存。为组装流动池，使用打孔器在一片双面胶带的中央切割出一个通道。
撕下双面胶带的纸面，将其粘贴到带有两个孔的玻璃片上。与撕下双面胶带的塑料面相比，撕下纸面更容易去除气泡。按压胶带以排除气泡。
然后使用金刚石尖头玻璃刻刀将经过功能化的盖玻片切割成四片，并用氮气吹去碎屑，保持功能化面朝上。撕去双面胶带的塑料层，将载玻片粘贴到功能化的盖玻片上。轻轻按压，以去除盖玻片与胶带之间的气泡。
彻底去除气泡可防止缓冲液泵入时流通池发生泄漏。现在将进样管插入小孔中，将出样管插入大孔中，并使用环氧树脂固定管路。
使用注射器手动将20微升浓度为0.2毫克/毫升的链霉亲和素泵入流动池，室温孵育10分钟。随后将封闭缓冲液泵入流动池以替换链霉亲和素，并保持在室温。在荧光显微镜测试载玻片1号上，通过532纳米激光和640纳米激光同时激发，获得A5处红色与远红荧光的焦平面校准。
使用分光光学元件生成双波长图像。将流动池放置在显微镜上，并将其出口管路连接至一段更长的管路，该管路连接至安装在自动输注-抽取程序泵上的10毫升弹簧。通过注入封闭缓冲液并翻转出口管路，去除流动池中的气泡。
将0.5微升生物素标记的lambda-ARS317 DNA加入80微升封闭缓冲液中。以每分钟25微升的速度将配制好的混合液泵入流动池，持续2分钟。随后以每分钟50微升的速度用200微升封闭缓冲液冲洗lambda-ARS317 DNA。
现在以每分钟 50 微升的流速向流通池中泵入 200 微升结合缓冲液，以去除封闭缓冲液。接着，将 2 微升 ORC-Qdot705、1 微升 DTT 和 1 微升 ATP 加入 96 微升结合缓冲液中。ORC-Qdot705 的终浓度为 0.2 纳摩尔。
按照文本方案中详述的方法泵入结合缓冲液后，以每分钟10微升的流速将20微升制备好的ORC-Qdot705溶液泵入流动池。以每分钟100微升的流速用200微升结合缓冲液冲洗过量的ORC-Qdot705。然后以每分钟100微升的流速将含有30纳摩尔SYTOX Orange的结合缓冲液泵入流动池，以标记DNA底物。
最后，使用405纳米激光激发ORC-Qdot705信号，使用532纳米激光激发SYTOX Orange染色的DNA信号。通过四通道带通滤光片，以每分钟100微升的流速同时观察信号。使用EMCCD以每帧100毫秒的时间记录图像。
此处展示了lambda-ARS317 DNA底物的示意图。用405纳米激光激发标记Qdot705的ORC。用532纳米激光激发经SYTOX Orange染色的DNA。
合并结果表明，标记Qdot705的ORC结合于ARS317位点。ORC在lambda-ARS317 DNA上的结合分布结果显示，ORC在ARS317处具有高丰度的结合。在此基础上，可进一步采用单分子FRET等其他方法，以探究有关蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质动态行为的更多问题。
该技术发展之后，为单分子荧光成像领域的研究人员探索体外重建系统中DNA复制和DNA修复过程中的DNA-蛋白质相互作用铺平了道路。请务必注意，使用Piranha溶液具有极高的危险性，在进行该操作时，必须采取佩戴防护面罩等安全预防措施。
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概述
本文介绍了一种利用全内反射荧光显微镜（TIRFM）研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。该方法采用位点特异性修饰的λ DNA底物和量子点标记的蛋白质，以实现单分子成像。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 分子生物学
背景
- 理解DNA与蛋白质的相互作用对于研究DNA复制和基因修复至关重要。
- 单分子成像技术可提供分子动态的详细信息。
- 该实验方案旨在简化用于全内反射荧光显微镜（TIRFM）的流动池组装过程。
- 可视化演示有助于该方法的学习与应用。
研究目的
- 建立一种可靠的研究DNA-蛋白质相互作用的实验方案。
- 加深对染色体结构维持中分子机制的理解。
- 推动单分子成像技术相关研究的发展。
使用的方法
- 制备修饰的λ DNA底物。
- 用量子点标记蛋白质。
- 组装用于TIRFM成像的流动池。
- 清洗并准备盖玻片以获得最佳成像条件。
主要结果
- 该方案可有效实现DNA-蛋白质相互作用的可视化。
- 成功展示了标记蛋白质与DNA相互作用的成像结果。
- 提供了克服流动池组装中常见问题的分步操作指南。
- 强调了盖玻片清洗步骤的重要性。
结论
- 该方法可增强对DNA-蛋白质相互作用的研究。
- 它为分子生物学领域的研究人员提供了一种有价值的工具。
- 未来应用可能扩展到遗传学研究的各个方面。
常见问题
行业重要性概要
利用量子点标记的蛋白质和位点特异性修饰的λ DNA，通过单分子成像技术可视化 DNA-蛋白质相互作用，可直接探究复制与修复过程中潜在的分子机制。该方法通过提供高分辨率、定量的结合事件及空间定位信息，增强了靶点验证的预测可信度。该技术适用于药物研发早期的关键发现阶段，在此阶段，机制性去风险化和功能验证对项目推进至关重要。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在单分子水平上直接观察蛋白质与DNA结合的特异性和定位。
- 通过阐明候选靶点的功能性参与，支持作用机制的风险评估。
- 促进以假设驱动的方式探究与疾病模型相关的复制和修复通路。
- 基于实时分子相互作用提供靶点筛选的基础数据。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的单分子成像系统，用于下游筛选工作流程。
- 利用量子点（Qdots）实现可重复、高稳定性的荧光标记，支持长时间观察窗口。
- 能够对结合事件进行定量测量，有助于检测方法的标准化和可扩展性。
- 构建稳健的平台，用于评估化合物对DNA-蛋白质相互作用的影响。
转化与临床前研究
- 将体外机制研究结果与疾病相关的DNA复制和修复过程相联系。
- 通过实现详细的分子表征，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 通过提供靶点结合和功能相关性的直接证据，降低转化风险。
流程与工作流整合
该单分子成像方案可融入从早期机制研究到临床前模型验证的整个发现流程，支持靶点验证和检测方法开发两个阶段。
- Discovery Biology：为DNA-蛋白质相互作用研究中的假设验证和通路阐明提供高分辨率可视化。
- Screening：提供可重复的定量读数，适用于检测方法开发和化合物筛选。
- Analytics：能够在不同实验条件下对结合分布和定位模式进行统计学比较。
- Translational Research：通过体外模拟复制和修复事件，将机制性研究结果与疾病相关系统相联系。
- Enterprise Reuse：提供可重复使用的成像平台，可适应不同治疗领域中多种蛋白质-DNA相互作用研究。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：采用稳定、抗光漂的Qdot标记和可重复的流动池组装，实现成像工作流程的标准化。
- 战略价值：通过提供分子相互作用和靶点结合的直接证据，支持决策推进或终止项目。
- 项目组合影响：支持对发现阶段资产进行基于风险调整的优先排序和推进。
实施注意事项
- 需要具备单分子荧光显微镜和流动池组装方面的专业知识。
- 需要配备全内反射荧光显微镜（TIRFM）仪器和高灵敏度电子倍增CCD（EMCCD）成像系统。
- 需要对盖玻片进行严格的清洗和功能化处理，以确保实验的可重复性。
- 应用于其他蛋白质-DNA体系时，可能需要优化标记方法和缓冲条件。
- 量子点的光稳定性限制了其在需要动态强度测量的定量分析中的应用。
