一种高效的腺病毒制备方法

欢迎来到位于罗马尼亚布加勒斯特的尼古拉·西米奥内斯库细胞生物学与病理学研究所。在本病毒转导实验室中，我们将展示利用基于Vogelstein教授开发的AdEasy系统优化后的方法进行腺病毒颗粒生产的一部分流程。该腺病毒生产技术的主要步骤包括：第一步，在BJ5183细菌中将含有GFP的pAdTrack质粒与pAdEasy-1质粒进行重组。

第二步，腺病毒颗粒的包装；第三步，在AD293细胞中扩增腺病毒；第四步，从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒。

五、腺病毒的病毒滴度测定与功能检测。在此，我们将介绍该方法学中的一个重要步骤：从细胞裂解液和培养基中纯化腺病毒颗粒。

腺病毒的纯化首先从收获产病毒细胞及其培养基开始。AD293细胞被转染重组质粒后，腺病毒得以包装。随后通过逐级扩大培养对腺病毒进行扩增。

在此，我们准备了25个T175培养瓶，并开始从细胞裂解物和培养基中纯化腺病毒。首先，我们检测了转导细胞表达的GFP的绿色荧光。如果细胞仍然贴壁，可通过轻敲培养皿或使用长刮刀将细胞刮下。

收集细胞和培养基。用 PBS 清洗培养瓶，并将 PBS 也收集到 Falcon 管中。通过离心将细胞沉淀。

保留细胞沉淀以及培养基，用于后续腺病毒的纯化。此步骤中，建议由一位同事协助，以加快收获过程。由于表达GFP，细胞沉淀呈绿色。

将沉淀重悬于高渗Tris缓冲液中，这有助于细胞的破裂。对于细胞裂解，我们使用液氮以及加热至37摄氏度的干燥气体。裂解循环次数不得超过三次，否则病毒将受到损伤。

为提高细胞破碎效率，需小心地将细胞匀浆液通过23号针头反复抽打。将细胞裂解物在9,600 × g离心12分钟。将上清液转移至新的离心管中，并弃去沉淀。

将上清液置于冰上，以备后续超速离心处理。现在，我们对培养基进行处理，以分离从细胞中释放的腺病毒。为此，首先称取所需量的硫酸铵，并将其加入收集培养基的瓶子中。

将瓶子剧烈振荡，直至晶体完全溶解。混合物在室温下孵育两个半小时。然后将沉淀物的悬液分装到Falcon管中。

在1,600 × g条件下离心15分钟。离心后弃去上清液，将沉淀重悬于10毫摩尔Tris缓冲液中。若无法立即通过超速离心步骤继续进行腺病毒的纯化，则沉淀物经透析去除硫酸铵后，可在4摄氏度保存数天。

此处我们介绍透析步骤。使用注射器将悬浮液注入预先润湿的透析盒中。样品在4°C条件下，于10毫摩尔Tris缓冲液中透析过夜。

纯化的最后一步是在氯化铯不连续梯度上进行超速离心。为了形成梯度，首先用移液器吸取3 mL高密度的氯化铯溶液。在此层上方，轻轻加入3 mL低密度氯化铯溶液。

将来自细胞裂解液或培养基的腺病毒颗粒悬液覆盖在梯度液顶部。用矿物油充满离心管，并放入SW41离心桶中。平衡后，将离心管对称装载到转子中，然后将转子放入超速离心机内。

离心机以35,000 RPM的转速在4°C下连续运行18小时。超速离心后，将离心管放置在带有黑色背景纸的支架上，以便收集条带。将上层透明相和细胞碎片弃入含有漂白液的废液容器中。

用移液枪头吸取含有完整腺病毒的最低条带，并收集至无菌的Eppendorf管中。透析后，向病毒悬液中加入蔗糖，使其终浓度为4%，并将病毒分装后于-80摄氏度冷冻保存。在结果部分，我们展示了用所获得的腺病毒感染的细胞中GFP的表达情况。

转导后48小时，通过荧光显微镜观察可见，转导细胞表达绿色荧光蛋白（GFP）。通过流式细胞术测定表达GFP的细胞百分比。使用每细胞25个转导单位转导的人源和牛源内皮细胞中，约有50%呈GFP阳性。

当仅使用每细胞五个转导单位时，小鼠肝细胞获得了相同的转导效率，但由于细胞敏感性，这与较高的死亡率相关。由于特异性受体表达水平较低，间充质基质细胞的转导导致GFP表达降低。结论。

我们优化了这些繁琐的技术，以减少获得腺病毒颗粒所需的时间、成本和工作量。所制备的腺病毒能够感染多种细胞类型，并可诱导目的基因的表达。