利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

本实验的总体目标是利用抗原衣壳整合策略，以重组二价腺病毒载体作为概念验证，开发基于5型腺病毒载体的疫苗方法。通过抗原衣壳整合策略，采用多步克隆技术构建修饰型质粒A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss，随后构建二价腺病毒载体R one K-HVR five。

Hiss 被拯救、扩增并纯化，随后对病毒滴度以及病毒衣壳上整合抗原的抗原展示进行表征。最后，通过抗原衣壳整合策略评估双价腺病毒载体克服 D5 阳性血清中和作用的潜力。

构建修饰质粒 A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss 时采用了多个克隆步骤。今天我们将演示抗原衣壳整合策略。与转基因表达法等其他策略相比，该策略具有优势，因为它不仅能在腺病毒衣壳上以蛋白质形式展示目标抗原，还能诱导针对该抗原的强烈体液免疫反应。

该方法的可视化演示至关重要，因为关于制备帽修饰腺病毒的步骤较难掌握，其病毒载体的构建涉及多个影响因素，例如限制性内切酶的选择以及目标能量片段的筛选等操作流程的展示。今天参与演示的有两位博士后：Dr. Lin Lin Gu 和 Dr. Nitra Farrow，以及实验室研究助理 Alexandre Kren。为构建穿梭质粒，需将各六单位的 GE one 和 CCC one 加入六微克的 HVR one KWA 片段中。

将消化反应在 37 摄氏度孵育 3 小时。通过电泳在 2% 琼脂糖凝胶中分离消化片段，并根据制造商说明书使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化该片段。随后，将 12 纳克纯化片段连接至 100 纳克先前构建的穿梭质粒的 AflII 和 AccI 酶切位点。

在室温下，以5 µL 10×连接缓冲液、1 µL ATP（10 mM）、1 µL T4 DNA连接酶、50 ng载体DNA、10倍摩尔过量的插入片段，总体积为10 µL，反应2小时。然后取1 µL连接反应产物加入50 µL电转感受态DH5α细胞中，电击转化后立即加入950 µL SOC培养基。将转化后的细胞在37°C、200 rpm条件下振荡培养1小时，随后取100至200 µL培养物涂布于LB氨苄青霉素平板上。

在37摄氏度下孵育过夜。使用6单位Echo R1和PME1，在37摄氏度下消化6微克纯化的穿梭质粒3小时。纯化含有同源重组臂和双修饰外显子5基因的片段后，使用SUA1线性化骨架质粒PAD5 ΔH5，以进行同源重组。

采用电穿孔法将各100纳克纯化的穿梭片段和骨架质粒共同转化至50微升电转感受态BJ5180细胞中。如本视频此前所示，次日挑取约10个菌落接种于3毫升含卡那霉素的液体LB培养基中，过夜培养后按照文本方案进行筛选。随后，将100纳克纯化的质粒转化至DH5α细胞中，操作方法如前所述，以拯救腺病毒载体。

首先使用PAC I在100微升体系中线性化15微升的载体。消化完成后，在37摄氏度孵育3小时。在通风橱中提取线性化的质粒。

加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇，于10,000 G离心1分钟，收集上清液，然后重复提取并离心至所需提取体积。加入300微升100%乙醇和10微升乙酸盐，于10,000 G离心10分钟。弃去上清液后，加入700微升70%乙醇，再次离心。

将沉淀重悬并定量DNA后，按照生产商说明书，将三微克线性化质粒与商用脂质体转染试剂共同转染至已预先准备的、汇合度为80%的T25培养瓶中的HEK 293细胞。转染孵育六小时后，更换为完全培养基，再将培养瓶放回培养箱继续培养。当在无菌操作台下观察到细胞病变效应（CPE）完全形成时，刮下培养瓶中剩余的细胞，并于4°C、300 ×g条件下离心培养物10分钟。

然后用含有2%FBS的1毫升培养基重悬细胞沉淀。接着，通过四次冻融循环裂解细胞，随后在4°C下离心10分钟。收集含有拯救病毒的S上清，用于在大规模培养中扩增病毒载体。

将 T25 培养瓶中三分之一至全部病毒裂解液加入含有 HEK293 细胞的 T75 培养瓶中。待完全出现细胞病变效应（CPE）后，按前述方法收集上清液，将其中一半病毒接种至一个或多个 T175 培养瓶的 HEK293 细胞中进行扩增，随后将从 T175 培养瓶中分离的病毒在十二个或更多 T175 培养瓶中进一步扩增。

在制备1.33克/毫升和1.45克/毫升的氯化铯溶液后，取T175细胞培养瓶中的细胞。向超速离心管中加入4毫升1.33克/毫升的氯化铯溶液，再向同一管底部加入4毫升1.45克/毫升的氯化铯溶液。然后将4毫升病毒裂解上清液加至同一管的顶部，随后在4°C、110,000 ×g条件下离心3小时。

这将使成熟的下部病毒条带与有缺陷的上部病毒条带在通风橱中分离。使用连接在3毫升注射器上的33号针头收集下部条带。然后加入五个海波（hippies）使溶液总体积达到4毫升。

然后制备另外两份氯化铯梯度，将稀释后的病毒加在梯度顶部，在4°C条件下于110,000 G离心过夜。在通风橱内操作。按前述方法收集病毒条带。

然后使用33号针头和3毫升注射器将病毒溶液注入透析盒中。将透析盒置于700毫升按文本方案配制的1×透析缓冲液中，每3小时更换一次缓冲液，共更换4次。然后使用针头和注射器。

收集盒式装置中的病毒溶液，以测定病毒的物理滴度。使用病毒裂解缓冲液将病毒以及用作背景对照的透析缓冲液分别按1:10和1:20稀释，并将所有试管在56摄氏度孵育10分钟。打开生物分光光度计，将吸光度模式设置为260纳米的光密度。

通过点击空白按钮，使用稀释至1:10的透析缓冲液平衡背景信号。在生物光度计屏幕上输入10加90。将试管更换为稀释至1:10的病毒溶液管，读取稀释至1:10的病毒信号。

为测定1:20稀释度，先使用1:20稀释的透析缓冲液平衡背景，在屏幕上显示5加95，然后将缓冲液管更换为1:20稀释的病毒管并读取信号。将两次病毒读数乘以1.1×10¹²，并根据两次稀释样本所得的单独滴度计算平均滴度，单位为每毫升病毒颗粒数（VP/mL）。按照文本方案在小鼠中评估病毒，以验证所拯救的病毒是否在病毒衣壳表面展示抗原性HIV抗原和组氨酸标签。

主要蛋白Heon五。ELISA实验分别使用人源2F5单克隆抗体和小鼠抗His标签单克隆抗体进行，结果如图所示：人源2F5抗体和小鼠抗His抗体均结合于二价Add5病毒颗粒，而阴性对照无结合信号。采用A5载体进行Western blot分析以验证ELISA结果，人源2F5抗体和小鼠抗His抗体均仅检测到约117千道尔顿的特异性条带。

在五型腺病毒中添加了五价蛋白，其大小与Heon五蛋白相对应。为了评估构建的五型腺病毒逃避五型阳性血清中和的能力，进行了中和实验。结果显示，当对照五型载体未经五型阳性血清处理时，相对发光单位（RLU）比经血清处理时高出12倍，表明病毒被中和。

相比之下，处理与未处理样本在R利用方面对构建的二价AD五型病毒几乎没有差异，表明构建的病毒逃避免疫中和作用。观看本视频后，您应对用于腺病毒5型载体疫苗开发的抗原衣壳整合方法有更深入的理解。目前，我们正在将此策略与稀有血清型载体联合使用。

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