多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

本方案结合了荧光RNAscope原位杂交与免疫组织化学技术，适用于新鲜冷冻或固定的脑组织样本。该技术通过将高灵敏度的原位杂交与免疫组织化学方法相结合，可在同一样本中实现RNA和蛋白质靶标的精确定位可视化，具有较高的灵活性。该方法适用于脑组织切片的多重标记，有助于神经科学研究中对异质性神经元群体内mRNA与蛋白质的空间分布特征及其功能意义的探究。

本方案主要关注新鲜冷冻组织和多聚甲醛固定组织的处理步骤。开始切片新鲜冷冻脑组织时，将其固定在预冷的冷冻切片机样品头 上，切取14 µm厚的冠状切面。将切片贴附至带电荷的玻璃显微镜载玻片上。

将已固定的载玻片放入载玻片盒中，然后将盒子置于干冰上，运送到-80摄氏度的超低温冰箱中。进行组织固定时，需过滤配制好的多聚甲醛溶液。

将其冷却至 4 摄氏度。将载玻片从零下 80 摄氏度的冰箱中用干冰取出，并立即浸入预冷的多聚甲醛溶液中固定 15 分钟。对新鲜冷冻组织进行脱水处理，确保玻片完全干燥。从经心脏灌注固定的动物取出脑组织后，使用振动切片机切割成 30 µm 厚的组织切片。

将切好的组织片段保存在冷冻保护液中。在进行FISH实验当天，将游离的组织片段转移至含有0.1摩尔PBS的12孔细胞培养板中，并在旋转摇床上以90至100 RPM的速度振荡，以去除冷冻保护液。随后，使用画笔将组织片段平整地贴附于玻璃显微镜载玻片上，防止在洗涤过程中脱落，并在空气中干燥至少两个小时。

使用疏水屏障笔在切片周围绘制疏水屏障，以容纳FISH试剂。预处理后，组织在蛋白酶溶液中孵育，并按照制造商的说明与RNAscope探针杂交两小时。随后进行连续的扩增步骤和荧光免疫组织化学染色。

首先准备一个加湿且避光的孵育盒用于孵育载玻片。在水浴中将50X洗涤缓冲液和探针加热至40摄氏度，持续10分钟。待其冷却至室温后，用50X储备液配制一升1X洗涤缓冲液。

按照文稿中的描述制备探针混合物。进行蛋白酶处理时，将蛋白酶3加至组织切片上，并在室温下孵育30分钟。为洗去蛋白酶，需将载玻片轻轻浸入0.1摩尔PBS溶液中，于室温下洗涤，注意避免切片脱落。

进行杂交时，将探针混合物加至组织切片上，放入预热的湿盒中，于40摄氏度孵育两小时。

用洗涤缓冲液冲洗组织切片两次，每次两分钟。为了信号扩增，使用滴瓶将扩增溶液滴加至覆盖组织切片，并按照文中所述条件进行孵育。将封闭溶液滴加到组织切片上，在室温下孵育一小时，以防止非特异性结合。

孵育后轻弹载玻片以去除多余的封闭缓冲液。接着，在4摄氏度下将切片与一抗孵育过夜。次日，用1X TBS洗涤载玻片三次。

加入二抗，在室温下孵育切片两小时。使用配备相机的落射荧光显微镜观察载玻片。以20倍放大倍数采集代表性图像，并将其保存为TIF文件。

在本研究中，通过未出现 DAPI 标记确认了组织质量、完整性以及无细菌污染。针对泛素 C、肽基脯氨酰异构酶 B 和 RNA 聚合酶 IIA mRNA 的阳性对照探针的标记证实了 RNA 的完整性。在新鲜冷冻切片中，为了区分孤束核（NTS）内 GalR1 mRNA 阳性的神经元，使用了额外的神经化学标记物。

膜结合的囊泡转运蛋白被明显标记。相比之下，在PHOX2B启动子调控下表达的细胞质蛋白（如酪氨酸羟化酶和GFP）由于缺乏清晰的轮廓，仅微弱可见，呈絮状。细胞质中GalR1 mRNA的GalR1 FISH探针标记呈点状，清晰可见。

为了证实免疫组织化学的质量依赖于蛋白质的亚细胞定位，我们在同一组织切片中平行标记了不同的核内和胞质蛋白，并同时进行FISH检测。胞质内的PHOX2B GFP呈絮状外观，而核内的PHOX2B蛋白信号则清晰明确，这证实了当免疫标记与FISH联合使用时，核蛋白的免疫标记质量更高。

在固定冷冻切片上与FISH联合进行时，无论亚细胞定位如何，免疫组织化学结果均可靠。GlyT2 mRNA阳性神经元位于孤束核（NTS）腹侧，而非位于NTS内部。GlyT2 mRNA阳性神经元与PHOX2B mRNA阳性神经元不共定位。

一部分PHOX2B mRNA阳性的孤束核神经元呈酪氨酸羟化酶免疫反应阳性，且均不含有GlyT2 mRNA。RNAscope技术能够在细胞和组织中以单分子分辨率实现RNA分布的可视化与分析，为新RNA物种、疾病机制、基因表达模式、神经元多样性及细胞间相互作用的研究提供了有力支持。